胱硫醚γ裂解酶/硫化氢通路失调在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞炎症中的作用

摘要

目的:
　　研究胱硫醚γ裂解酶(Cystathionineγ-lyase,CSE)/硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)通路在氧化低密度脂蛋白(Oxidized LDL,ox-LDL)诱导的巨噬细胞炎症中的作用,并探讨其相关机制。
　　方法:
　　以Raw264.7细胞和小鼠原代腹腔巨噬细胞为研究对象,采用ox-LDL建立细胞炎症模型。
　　采用逆转录PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及Western blot法检测胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionineγ-lyase,CSE)的转录及表达变化;采用亚甲蓝法检测细胞外HS-浓度变化;采用瞬时转染技术构建CSE过表达及基因敲减的细胞模型;运用不同的CSE抑制剂为工具药抑制CSE活性;ELISA检测炎症相关因子肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)及细胞间粘附分子(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的生成和释放;采用粘附实验检测巨噬细胞与内皮细胞间的粘附;采用Western blot法检测IκBα及磷酸化IκBα的表达、免疫荧光方法检测NF-κB亚单位p65的亚细胞定位分布,结合ELISA法检测胞核中NF-κB的转录活性;采用Western blot的方法检测JNK、ERK、P38的磷酸化水平。
　　结果
　　RT-PCR结果显示正常培养条件下Raw264.7细胞仅表达CSE,而不表达胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)。Western blot和RT-PCR结果显示:与对照组相比,ox-LDL组CSE蛋白水平及mRNA水平均降低(p<0.05),且亚甲蓝法检测细胞外HS-浓度变化结果显示ox-LDL作用后,原代小鼠腹腔巨噬细胞及Raw264.7细胞胞外HS-浓度降低,提示ox-LDL抑制巨噬细胞CSE表达及H2S生成;利用瞬时转染技术构建过表达及敲减CSE,结果发现与转染载体组相比,CSE过表达组ox-LDL诱导的Raw264.7细胞TNF-α产生显著减少(P<0.01),而CSE敲减则使TNF-α产生明显升高(P<0.05);而用不同的H2S供体NaHS和Na2S预处理,发现与ox-LDL组相比,预处理组TNF-α产生显著降低,原代细胞结果也与此一致;NaHS预处理组ICAM-1生成和释放亦减少;粘附实验结果表明NaHS预处理组巨噬细胞与内皮细胞间的粘附数减少;与H2S供体作用相类似,H2S合成底物cysteine预处理亦可显著降低TNF-α生成,且该作用能被CSE抑制剂PAG和BCA逆转;Western blot及免疫荧光结果显示,ox-LDL能够促进IκBα、ERK及JNK磷酸化(P<0.01),并明显促使p65向细胞核内转位,而NaHS和Na2S能够抑制IκBα及JNK磷酸化(P<0.05),且减少巨噬细胞核内的p65水平。另外,RT-PCR结果显示NF-κB、ERK、JNK抑制剂均可部分逆转ox-LDL引起的CSE转录下调;ELISA结果显示JNK抑制剂能明显抑制ox-LDL诱导的NF-κB转录活性增加。
　　结论:
　　CSE/H2S通路在ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症模型中发挥重要的抗炎作用, ox-LDL可通过抑制JNK/NF-κB通路而减少CSE/H2S表达,从而加剧炎症发生。本研究可能为动脉粥样硬化治疗提供一个新的靶点。

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研究背景

材料和方法

1 实验材料

1.1 主要试剂

1.2 细胞株

实验仪器

1.4 溶液配制

2 实验方法

结果

1.ox-LDL对巨噬细胞CSE表达及H2S生成的影响

2. 内源性H2S抑制ox-LDL诱导巨噬细胞TNF-α的产生

3. 外源性H2S抑制ox-LDL诱导巨噬细胞TNF-α的产生

4. H2S抑制巨噬细胞ICAM-1的生成，并减少巨噬细胞与内皮细胞的粘附

5. H2S抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞NF-κB的激活

6. MAPK及NF-κB抑制剂对ox-LDL抑制CSE转录的影响

7. NaHS抑制ox-LDL诱导的JNK激活

讨论

参考文献

结论

综述 硫化氢在动脉粥样硬化中的研究进展及展望

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文及科研成果

致谢