C18神经酰胺在胶质瘤中的作用及其机制研究

摘要

目的：鞘糖脂在神经系统中含量丰富，分布广泛，并且具有重要的生理功能。脑部肿瘤是困扰人类健康的一大类肿瘤，包括脑膜瘤、垂体瘤和胶质瘤等。胶质瘤是最常见的恶性中枢神经肿瘤，死亡率极高，目前临床上并没有十分有效的治疗方法。本课题旨在研究鞘糖脂在脑部肿瘤的中特异性变化，研究肿瘤患者肿瘤组织中鞘糖脂的组成情况，对比正常对照查找其差异，找寻其规律。研究胶质瘤组织样本中神经酰胺的组成情况，将其与正常对照进行比较。找寻其差异并且研究这些差别与胶质瘤发生发展的关系，及其这些特异性的差别在细胞生理功能中所发挥的作用，以期来探索C18神经酰胺对胶质瘤的影响。研究在胶质瘤细胞系中过表达CERS1后导致细胞活力降低，细胞死亡增加的原因和机制，以期为C18神经酰胺在胶质瘤中作用机制提供线索。
　　方法：（1）采用有机溶剂超声波提取的方法提取脑膜瘤、垂体瘤和胶质瘤肿瘤组织样本和正常对照中的鞘糖脂；（2）将提取所得鞘糖脂进行甲基化修饰反应，使其具有较高的质谱响应以便更好的进行质谱分析；（3）对所得甲基化鞘糖脂进行质谱定性分析，确定各主要鞘糖脂的种类及具体结构，对比脑膜瘤、垂体瘤和胶质瘤肿瘤组织样本和正常对照中鞘糖脂的结构差异；（4）对所有脑膜瘤、垂体瘤和胶质瘤肿瘤组织样本和正常对照中鞘糖脂进行相对定量质谱分析，对比样本中鞘糖脂组成的差异；（5）对胶质瘤肿瘤组织与正常对照中的神经酰胺进行提取；（6）将提取所得神经酰胺进行甲基化修饰反应，使其具有较高的质谱响应以便更好的进行质谱分析；（7）对所得甲基化神经酰胺进行质谱定性分析，确定各主要神经酰胺的种类及具体结构；（8）对胶质瘤肿瘤组织样本和正常对照中神经酰胺进行相对定量质谱分析，对比样本中神经酰胺组成的差异；（9）在胶质瘤细胞系过表达CERS1，增加C18神经酰胺含量；（10）检测在胶质瘤细胞系中过表达CERS1或外源加入C18神经酰胺对细胞周期，细胞活力及细胞死亡的影响；（11）检测在胶质瘤细胞系中过表达CERS1或外源加入C18神经酰胺对化疗药物替尼泊苷敏感度的影响；（12）通过表达谱基因芯片检测胶质瘤细胞系中过表达CERS1后与对照相比的基因表达变化；（13）通过qRT-PCR和Western blot技术验证表达谱芯片的结果，检测在胶质瘤细胞系中过表达CERS1对内质网应激的影响，以及用RNA干扰技术阻断内质网应激信号传导来验证其参与其中；（14）通过Western blot和激光共聚焦显微镜来检测胶质瘤细胞系中过表达CER1对自噬的影响，并利用自噬抑制剂来进行验证；（15）通过Western blot来检测胶质瘤细胞系同过表达CERS1对PI3K/AKT信号通路的影响，并利用该通路激活剂IGF-1来进行验证。
　　结果：（1）通过多级质谱检测技术对各种样本中的不同鞘脂类进行定性分析。主要鉴定了4种中性鞘糖脂：GlcCer、LacCer、Gb3和Gb4，鉴定了主要的10种酸性鞘糖脂：GM3、GM2、GM1、GD3、GD2、GD1、GT3、O-Ac-GM3、O-Ac-GD3和O-Ac-GT3；（2）通过相对定量方法对这些鞘糖脂进行相对定量分析，发现在脑膜瘤患者肿瘤组织，垂体瘤患者肿瘤组织和胶质瘤患者肿瘤组织中的GlcCer含量比正常对照明显下降，而LacCer、Gb3和Gb4的含量在脑膜瘤患者肿瘤组织、垂体瘤患者肿瘤组织和胶质瘤患者肿瘤组织中比正常对照明显升高；（3）发现在胶质瘤的肿瘤组织中，其C18鞘糖脂的含量都要高于正常对照；（4）在正常对照中，主要的酸性鞘糖脂是GM1(70.36％),而在肿瘤组织中最主要的酸性鞘糖脂是GM3,比例分别是脑膜瘤肿瘤组织（Meningeoma，39.94%），垂体瘤肿瘤组织（Hypophysoma，41.30%），胶质瘤肿瘤组织（Glioma，37.36%）；（5）通过质谱检测，发现胶质瘤肿瘤组织中C18神经酰胺的含量显著低于正常对照；（6）在胶质瘤细胞系U251和A172中过表达CERS1，可以使细胞中C18神经酰胺的含量上升；（7）在U251和A172胶质瘤细胞系中过表达或外源加入C18神经酰胺会导致细胞活力下降，细胞死亡增多；（8）在U251和A172胶质瘤细胞系中过表达或外源加入C18神经酰胺联合替尼泊苷比单独使用替尼泊苷可以提高对肿瘤细胞的抑制率，增加细胞的死亡，还能抑制细胞的生长；（9）在胶质瘤细胞系U251中过表达CERS1后会引起其基因表达谱的变化；（10）根据表达谱芯片提供的线索，经过qRT-PCR和Western blot实验检测，发现在U251和A172胶质瘤细胞系中过表达CERS1会引起内质网应激反应，将内质网应激关键分子CHOP进行RNA干扰，可以恢复CERS1对细胞活力的降低作用；（11）通过Western blot和激光共聚焦显微镜检测，在U251和A172胶质瘤细胞系中过表达CER1可以引起细胞自噬，而加入自噬抑制剂3-MA可以恢复CERS1对细胞活力的降低作用；（12）Western blot 实验检测，发现在U251和A172胶质瘤细胞系中过表达CERS1会抑制PI3K/AKT信号通路，加入该通路激活剂IGF-1可以恢复CERS1对细胞活力的降低作用；（13）在U251和A172胶质瘤细胞系中过表达CERS1导致的细胞死亡是Bax和Bcl-2非依赖性的。
　　结论：脑膜瘤患者肿瘤组织、垂体瘤患者肿瘤组织和胶质瘤患者肿瘤组织的鞘糖脂含量有别于正常对照。其中胶质瘤的肿瘤组织中，其C18鞘糖脂的含量都要高于正常对照。胶质瘤患者肿瘤组织中C18神经酰胺含量显著低于正常对照。在胶质瘤细胞系中过表达CERS1或外源加入C18神经酰胺可以降低细胞活力，促进细胞死亡。并且其与替尼泊苷联用，还可以增加替尼泊苷对胶质瘤细胞系的化疗效果。在胶质瘤细胞系中过表达CERS1可以引起内质网应激反应，抑制PI3K/AKT信号通路，并引起致死性自噬，而这种细胞死亡是Bax和Bcl-2非依赖性的。

目录

声明

引言

第一部分 人脑部肿瘤鞘糖脂的定性、定量和组成分析

前言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 过表达CERS1促进胶质瘤死亡

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分 过表达CERS1引起胶质瘤细胞内质网应激和自噬及其机制

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

综述:神经酰胺在肿瘤发生发展中功能的研究进展

攻读学位期间公开发表的论文、专利

中英文缩略词汇表

致谢