丹参对成骨细胞和破骨细胞生物学行为的双向调控作用及其机制研究

摘要

第一部分丹参对小鼠前成骨细胞的增殖分化的影响及其与MAPK信号通路关系研究
　　目的：研究丹参对于小鼠前成骨细胞（MC3T3-E1）的增殖、分化及矿化的影响，并研究其与细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）和p38细胞信号通路的关系。
　　方法：分别用生药浓度为75mg/L、150mg/L、300mg/L的丹参注射液稀释液干预MC3T3-E1小鼠前成骨细胞，并设对照组；用CCK8法检测细胞增殖活性的改变，培养21d后茜素红染色法检测各组钙结节生成情况，实时荧光定量PCR（qPCR）法检测各组骨钙素（BGP）、Runt相关基因2（Runx2）mRNA表达情况。设300mg/L浓度的丹参干预组和对照组，蛋白免疫印迹法检测p-ERK1/2、p-p38蛋白的表达情况；用ERK1/2信号通路抑制剂PD98059和p38信号通路抑制剂SB203580分别抑制ERK1/2、p38通路后，qPCR检测成骨相关基因BGP、Runx2基因mRNA表达改变。
　　结果：与对照组相比，24h、48h、72h三个时间点，经不同浓度的丹参干预后MC3T3-E1细胞的OD值均较对照组升高，且呈浓度依赖性。培养21d后茜素红染色结果不同浓度丹参干预组钙结节生成数量比对照组明显增多（p＜0.01）。在4d和7d两个时间点，各个浓度丹参干预组的BGPmRNA、Runx2 mRNA相对表达量较对照组均增加，并呈浓度、时间依赖性。经过丹参干预后（300mg/L），磷酸化ERK1/2蛋白表达相对表达量是对照组的1.4倍（P＜0.05），磷酸化p38蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义。300mg/L丹参组比300mg/L丹参+PD98059组的BGPmRNA、Runx2mRNA相对表达量均明显增多，分别是1.35倍和1.08倍（P＜0.01、P＜0.05）；但与300mg/L丹参+SB203580组相比，BGPmRNA、Runx2mRNA相对表达量差异无统计学意义。
　　结论：丹参能促进成骨细胞增殖、分化，增进矿化作用，作用机制可能与激活MAPK信号通路中的ERK1/2通路有关，而与p38信号通路无明显相关。
　　第二部分丹参通过P38MAPK和JAK2/STAT3信号通路对高铁环境下MC3T3-E1小鼠前成骨细胞起保护作用
　　目的：研究丹参对高浓度铁离子环境下的MC3T3-E1小鼠前成骨细胞的增殖、成骨分化、矿化能力的影响，并探索其中的作用机制。
　　方法：在培养基中加入高浓度铁离子模拟成骨细胞铁蓄积，设F1组：50μmol/L的枸橼酸铁铵（ FAC）；F2组：200μmol/L的 FAC；D1+F2组：75mg/L的丹参+200μmol/L的FAC；D2+F2组：150mg/L的丹参+200μmol/L的FAC组；D3+F2组：300mg/L的丹参+200μmol/L的FAC组，及对照组；用CCK8法检测细胞增殖活性的改变；茜素红染色法检测各组钙结节生成情况；流式细胞术检测细胞凋亡率改变；实时荧光定量PCR法（qPCR）检测各组BGP、Runx2、Col1a基因mRNA表达情况。对F2组、D2+F2组及CON组用western blot检测磷酸化p38（p-p38）、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达情况。
　　结果：经过CCK8法检测，用一定浓度丹参处理的MC3T3-E1细胞（D1+F2组、D2+F2组）的存活率高于高铁组（F2组）的存活率（p＜0.01）；经茜素红染色法检测，D2+F2组的钙结节生成率明显大于F2组；经流式细胞术检测结果提示在高铁培养环境中加了不同浓度的丹参各组比单纯高铁组（F1、F2组）的MC3T3-E1凋亡率明显下降（p＜0.01）；经qPCR检测，相比高铁组（F2组），加了不同浓度的丹参各组，成骨相关基因（BGP、Runx2、Col1a）的mRNA的表达均明显增加（P＜0.05）；Western blot检测发现在高铁培养环境下p-p38、p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达量均明显增加（p＜0.01）。而加入一定浓度丹参后p-p38和p-JAK2蛋白的表达又明显减少（p＜0.01）。
　　结论：丹参能拮抗高浓度铁离子环境对MC3T3-E1小鼠前成骨细胞的增殖、成骨分化、矿化的抑制作用，并且减少细胞凋亡，故对铁蓄积环境下的成骨细胞起保护作用，其中的机制可能与丹参抑制了P38MAPK信号通路和JAK2/STAT3信号通路的激活有关。
　　第三部分丹参对小鼠巨噬细胞系RAW264.7的增殖、破骨分化和破骨功能的影响及其机制研究
　　目的：研究丹参对小鼠前破骨细胞RAW264.7的增殖、分化和破骨相关功能的影响和机制。
　　方法：采用RANKL诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞在体外向破骨细胞分化的模型，用不同浓度的丹参的水溶性成分混合物（丹参注射液稀释液）处理细胞,浓度分别为75mg/L、150mg/L、300mg/L，用CCK8法检测细胞的增殖活性，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色法检测各组破骨细胞数量；用荧光定量聚合酶反应（qPCR）检测破骨相关基因组织蛋白激酶（CTK）、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、TRAP的mRNA转录情况；western blot检测破骨相关蛋白TRAP、CTK、NFATc1的表达情况；利用荧光探针DCFH-DA显示各组细胞内的活性氧（ROS），并用荧光显微镜观测和多功能酶标仪上检测吸光度值两种方法检测ROS水平。
　　结果：CCK8检测结果提示丹参能抑制RAW264.7细胞的增殖活性，且呈浓度依赖性；TRAP染色提示丹参能抑制破骨细胞的生成和成熟；qPCR检测提示丹参能抑制破骨相关基因CTK、MMP-9、TRAP的mRNA的转录，且呈浓度依赖性；western blot检测结果示丹参能抑制破骨相关蛋白TRAP、CTK、NFATc1的表达；荧光显微镜和酶标仪检测均显示，丹参能减轻RAW264.7细胞内ROS水平且呈浓度依赖性。
　　结论：丹参能抑制RAW264.7细胞向破骨细胞方向分化，并能抑制RAW264.7细胞的增殖、破骨分化以及破骨相关功能，其中的机制与减少细胞内ROS生成和抑制NFATc1通路有关。

目录

声明

前言

参考文献

本研究技术路线图

第一部分 丹参对小鼠前成骨细胞的增殖分化的影响及其与MAPK信号通路关系研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 丹参通过P38和JAK2/STAT3信号通路对高铁环境下MC3T3-E1小鼠前成骨细胞起保护作用

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 丹参对小鼠前破骨细胞RAW264.7的增殖、分化和功能的影响

前言

材料和方法

3结果

讨论

参考文献

小结

综述一:丹参及其有效成分对骨代谢影响的研究进展

综述二:丹参对骨代谢相关细胞信号通路影响研究进展

英文缩略词表

攻读博士学位期间发表的论文

致谢