共刺激分子4-1BBL在肠癌细胞核优势表达的临床意义及对肠癌细胞生长和迁移能力的影响

摘要

共刺激分子4-1BBL在介导机体的免疫应答过程中发挥重要作用，并参与免疫稳态调节。既往研究表明：4-1BBL分子呈跨膜分子的形式表达于活化的巨噬细胞、B细胞、单核细胞、DCs等抗原提呈细胞和活化T细胞以及多种肿瘤细胞表面；也有研究表明，活化的免疫细胞和恶性肿瘤细胞可释放可溶性4-1BBL分子。前期研究发现了共刺激分子4-1BBL在肠癌细胞存在细胞核表达的形式，因而本研究探讨了肠癌细胞核表达4-1BBL的临床意义，并在此基础上构建了4-1BBL基因敲除细胞株，初步探讨了细胞核表达4-1BBL对肠癌细胞迁移能力的影响。
　　第一部分共刺激分子4-1BBL在结直肠癌组织的表达及临床意义
　　目的：探讨4-1BBL分子在肠癌细胞的存在形式，并探讨其临床意义。
　　方法：本部分研究选择了90例肠癌患者癌瘤组织和癌旁组织，通过组织芯片和免疫组化手段，分析了4-1BBL在肠癌组织的分布形式及其临床意义，并采用多个肠癌细胞株进一步证实了4-1BBL分子的存在形式。
　　结果：
　　1．4-1BBL分子在临床肠癌组织标本中表达明显高于癌旁组织（肠癌组织细胞核4-1BBL染色评分6.517±0.1910，明显高于癌组织细胞核4-1BBL表达的综合评分3.584±0.153，P<0.0001）。
　　2．4-1BBL分子可表达于细胞核且优势表达于细胞核（肠癌组织细胞核4-1BBL表达的综合评分为6.517±0.1910，明显高于癌旁组织4-1BBL的表达3.528±0.124，P<0.0001）。
　　3．不同年龄组和不同性别组的患者肠癌组织4-1BBL的细胞核和细胞浆表达均无差异；不同肿瘤大小和病理分级组患者肠癌组织4-1BBL的细胞核和细胞浆表达也无差异。
　　4．淋巴结累及组患者细胞核表达4-1BBL分子明显高于淋巴结未累及组。淋巴结转移组患者肿瘤组织细胞核4-1BBL表达评分为6.804±0.242，明显高于淋巴结未转移组患者肿瘤组织细胞核4-1BBL表达6.000±0.32，P<0.05。
　　5．临床III-IV期患者肠癌细胞核表达4-1BBL明显高于临床I-II期组。III-IV组患者肿瘤组织细胞核4-1BBL表达评分为6.837±0.230，明显高于I-II期组患者肿瘤组织细胞核4-1BBL表达评分5.900±0.341，P<0.05。
　　6．肠癌细胞核高表达4-1BBL组患者的生存时间38.53±3.16月，4-1BBL低表达组患者生存时间48.22±4.51月，通过 Kaplan-Meier法比较两组患者的生存曲线，细胞核高表达4-1BBL组生存时间明显低于4-1BBL低表达组，P<0.05。
　　7．通过免疫荧光染色和流式细胞术分析结果表明：4-1BBL分子并不表达于肠癌细胞株的细胞膜，而大量存在于细胞内；通过免疫荧光染色结合激光共聚焦的形态学观察，也进一步证实了4-1BBL分子表达于细胞核的存在形式是确切的。
　　结论：本部分研究发现了共刺激分子4-1BBL表达于细胞核的存在形式；肿瘤细胞核表达4-1BBL分子可能是一个新的肠癌预后指标；推测4-1BBL的核表达可能参与肠癌的转移和侵袭等恶性生物学行为。另外，本部分研究进一步证实了4-1BBL表达与细胞核的存在形式是确切的。
　　第二部分4-1BBL基因敲除及对肠癌细胞株迁移能力和生长的影响
　　目的：通过敲除肠癌细胞4-1BBL基因，探讨细胞核内4-1BBL对肠癌细胞恶性生物学行为的影响。
　　方法：通过生物信息学手段选取编码人4-1BBL第1外显子（exon1）的基因序列，根据 Crisper/Cas9的设计原则确定靶向 exon1的 gRNA序列，将相应引物导入Crisper/Cas9基因敲除载体 PGK1.2，构建靶向人4-1BBL的基因敲除载体PGK1.2/H4LK-7，将载体导入肠癌细胞株HCT116，分选GFP阳性细胞株并亚克隆，选取单克隆生长的细胞，通过细胞内染色和流式细胞术分析筛选4-1BBL表达阴性细胞株。而后通过体内外实验探讨4-1BBL基因敲除对肠癌细胞迁移、增殖速度和肿瘤体内生长的影响。
　　结果：
　　1．成功构建构建靶向人4-1BBL的基因敲除载体PGK1.2/H4LK-7。
　　2．载体PGK1.2/H4LK-7成功导入肠癌细胞株HCT116，并成功表达GFP蛋白。
　　3．成功获得敲除4-1BBL的肠癌细胞株，命名为HCT116/4LKO，转染空载体的对照组细胞命名为HCT116/cas9only。
　　4．敲除细胞核4-1BBL可影响肠癌细胞株的迁移能力。迁移实验结果表明，经血清饥饿处理12 h的 HCT116/4LKO细胞经24 h向含血清培养基迁移的细胞为为10.60±0.51个/高倍镜视野，明显低于HCT116/cas9only细胞22.60±3.14个/高倍镜视野，P<0.01。
　　5．敲除细胞核表达的4-1BBL可影响肠癌细胞的体内外生长。HCT116/4LKO细胞的体外倍增时间为16.2 h，而HCT116/cas9only细胞的体外倍增时间为18.1 h；划痕愈合实验结果表明，4-1BBL基因敲除可明显减缓划痕愈合时间；而裸鼠荷瘤模型进一步证实了4-1BBL基因敲除可降低肠癌生长速度。
　　结论：上述研究结果初步验证了肠癌细胞核4-1BBL分子与肠癌细胞的迁移和生长有关，与第一部分的临床研究结果相符并为探讨其确切机制提供了线索。
　　而细胞核内4-1BBL对肠癌细胞迁移、侵袭和生长等生物学行为的影响如何？细胞核表达4-1BBL对肠癌细胞生物学应为的影响是通过何种信号转导机制？其他种类肿瘤细胞是否存在4-1BBL分子的核表达，即这一生物学现象是否存在普遍性？这些科学问题有待进一步探讨。

目录

声明

序言

一、肠癌概况

二、肿瘤微环境与肿瘤细胞

三、共刺激分子与肿瘤微环境和肿瘤细胞

四、共刺激分子4-1BBL与免疫调节及其介导的肿瘤免疫应答

参考文献

第一部分 共刺激分子4-1BBL在结直肠癌组织的表达及临床意义

前言

1 材料和方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第二部分 4-1BBL基因敲除及对肠癌细胞株迁移和增殖能力的影响

1 实验材料和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

参考文献

总结与展望

全文总结

展望

综述:共刺激分子与肿瘤免疫病理机制、诊断和治疗

附录：GPR49分子在胰腺癌组织的表达及其临床意义

攻读学位期间公开发表的论文

本研究所获的基金资助

中英文对照缩略词表

致谢