儿茶酚胺介质对类风湿性关节炎模型小鼠的Th17/Treg失衡及关节炎症的作用

摘要

目的：儿茶酚胺（catecholamines,CAs）主要包括去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、肾上腺素（epinephrine,E）和多巴胺（dopamine,DA）。酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）是合成CAs的限速酶。长期以来，CAs一直被认为主要由神经细胞和内分泌细胞合成和分泌，以调节机体的循环、呼吸和消化等功能。近年来的研究发现，CAs也参与调控机体的免疫功能。本实验室先前的研究发现CAs能够调节辅助性 T（T helper, Th）细胞的分化及功能，可以促进 Th1细胞向 Th2细胞方向分化，提示CAs有抑制促炎免疫细胞的作用。我们假设CAs对自身免疫性疾病也有作用。类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种是一种以慢性滑膜炎症伴发关节软骨和骨损伤为特征的自身免疫性疾病，Th17细胞与调节性T（regulatory T,Treg）细胞之间的功能失衡是导致RA发病的发病机制之一。为此，本研究利用RA的动物模型—胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）探讨CAs对CIA小鼠的Th17/Treg失衡、关节炎症和骨损伤的作用，为自身免疫性疾病的神经内分泌调节机制提供新的线索。
　　方法：
　　1.用鸡II型胶原（collagen II,CII）免疫8-10周雄性DBA/1小鼠，诱导关节炎发生。自初次免疫后第21天开始，观察四肢临床评分；初次免疫后第35天和第55天，检测踝关节宽度和后足厚度、踝关节组织病理学改变（HE染色）及血清抗CII-IgG的抗体水平（ELISA法）。
　　2.用real-time PCR，Western blot和ELISA法测定小鼠踝关节组织及关节组织上清、脾脏和血清中Th17细胞的特异性转录因子-维甲酸相关孤儿受体（retinoid-related orphan nuclear receptor,ROR）-γt，细胞因子-白介素（interleukin,IL）-17和IL-22的表达和分泌；Treg细胞的特异性转录因子-特异性转录因子叉头蛋白p3（forkhead box p3,Foxp3），细胞因子-转化生长因子（transforming growth factor,TGF）-β和IL-10的表达和分泌。用Western blot法检测小鼠踝关节和脾脏中TH、囊泡单胺转运体（vesicular monoamine transporter,VMAT）-2和单胺氧化酶（monoamine oxidase,MAO）的表达。用免疫荧光染色法观察小鼠踝关节滑膜组织及脾脏中ROR-γt和Foxp3分别与TH、VMAT-2和MAO的共表达。用流式细胞术测定小鼠脾脏CD4+T细胞中IL-17+TH+细胞和CD25+TH+细胞的百分比。
　　3.初次免疫后第41天，分离纯化CIA小鼠脾脏中的CD4+T细胞，用TH基因过表达或沉默的质粒转染CD4+T细胞。用Western blot法检测细胞中TH的表达；用real-time PCR，Western blot和ELISA法检测细胞中及细胞上清中Th17和Treg细胞的特异性转录因子和细胞因子的表达和分泌；流式细胞术测定CD4+T细胞中Th17和Treg细胞的百分比。
　　4.初次免疫后第33和41天，在CIA小鼠足部注射TH基因过表达和沉默的慢病毒，观察四肢临床评分直至初次免疫后第69天，检测踝关节宽度和后足厚度、踝关节组织病理学改变及血清抗CII-IgG的抗体水平。用Western blot法检测关节中TH的表达；用real-time PCR，Western blot和ELISA法检测关节、关节组织上清、脾脏及血清中Th17和Treg细胞的特异性转录因子和细胞因子的表达和分泌；流式细胞术测定脾脏CD4+T细胞中Th17和Treg细胞的百分比。抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色检测踝关节中破骨细胞的改变；real-time PCR法检测踝关节中破骨细胞特异性基因TRAP、Ctsk、Ctr和MMP-9和成骨细胞特异性基因ALP、Osteocalcin、Col1α1和Col1α2的表达变化。
　　结果：
　　1.CIA小鼠自初次免疫后第31天开始四肢临床评分增高，免疫后第35天到达高峰，并且踝关节宽度和后足厚度增加，血清抗CII-IgG抗体水平升高。病理学检查显示CIA小鼠踝关节中滑膜组织增生、关节腔隙变窄、炎症细胞浸润，初次免疫后55天小鼠有明显的关节骨质破坏。
　　2.CIA小鼠踝关节、关节组织上清、脾脏及血清中ROR-γt、IL-17、IL-22的表达和分泌增加，踝关节、关节组织上清及血清中Foxp3、TGF-β和IL-10的表达和分泌增加，并且随着疾病的进展，Th17细胞反应有所减弱，Treg细胞反应趋于加强。
　　3.在CIA小鼠的踝关节和脾脏中，TH、VMAT-2和MAO的表达显著增加。在CIA小鼠的关节滑膜组织，对照和CIA小鼠的脾脏中有ROR-γt和Foxp3分别与TH、VMAT-2和MAO的共表达。CIA小鼠脾脏的CD4+T细胞中TH表达增加，表达TH的细胞主要是Th17细胞。
　　4.CIA小鼠CD4+T细胞中的TH基因过表达后Th17细胞数及相关转录因子和细胞因子的表达和分泌降低，TH基因沉默后进一步增强了Th17细胞的功能。CIA小鼠CD4+T细胞中的TH基因过表达后进一步增加了Treg细胞相关细胞因子的表达和分泌，TH基因沉默后减弱了Treg细胞的功能。
　　5.CIA小鼠足部TH基因过表达后关节红肿明显减轻、临床评分降低、关节腔炎性细胞浸润减少，TH基因沉默后反之。
　　6.CIA小鼠足部TH基因过表达后关节和关节组织上清中Th17细胞相关转录因子和细胞因子的表达和分泌减少，TH基因沉默后进一步增强了Th17细胞的功能。CIA小鼠足部TH基因过表达后进一步增加了关节和关节上清中Treg细胞相关细胞因子的表达和分泌，TH基因沉默后减弱了Treg细胞的功能。
　　7.CIA小鼠足部TH基因过表达后破骨细胞特异性基因的表达降低，TH基因沉默后增加了破骨细胞的功能。CIA小鼠足部的TH基因过表达后成骨细胞特异性基因的表达增加，TH基因沉默后减弱了成骨细胞的功能。
　　8.CIA小鼠足部TH基因过表达和沉默对血清中抗CII-IgG的抗体水平、脾脏中Th17和Treg细胞特异性核转录因子和细胞因子的表达、脾脏中Th17和Treg细胞数及血清中细胞因子的分泌无显著影响。
　　结论：
　　1.RA模型小鼠体内存在Th17/Treg功能的失衡。
　　2.RA模型小鼠的踝关节和脾脏中CAs的合成、储存和降解均增加。
　　3.Th17细胞和Treg细胞均能合成、储存和降解CAs，并且在关节炎中Th17细胞合成CAs增加，其意义可能与抑制Th17/Treg的失衡有关。
　　4.CAs具有抑制Th17/Treg失衡、减轻关节炎症及骨损伤的作用。

目录

声明

前言

材料与方法

1 材料

2实验流程及方法

结果

1. CIA小鼠的临床表现、病理学改变及血清中抗CII-IgG抗体水平的变化

2. CIA 小鼠踝关节、脾脏和血清中Th17和Treg细胞相关的核转录因子和细胞因子的表达和分泌变化

3. CIA小鼠踝关节和脾脏中TH、VMAT-2和MAO表达的变化

4. CIA小鼠踝关节滑膜组织与脾脏中Th17和Treg细胞相关的核转录因子ROR-γt 和 Foxp3分别与TH、VMAT-2和MAO的共表达

5. CIA 小鼠脾脏中CD4+IL-17+TH+细胞数增加，但CD4+CD25+TH+细胞数不变

6. CIA小鼠CD4+T细胞中的TH基因过表达或沉默后对Th17和Treg细胞功能和分化的影响

7. CIA 小鼠足部注射 TH 基因过表达或沉默的慢病毒后对 Th17和 Treg细胞的功能和分化、关节炎症及骨损伤的影响

讨论

结论

参考文献

综述: 儿茶酚胺类递质对自身免疫性疾病的作用及受体信号机制

英文缩写词表（Abbreviation）

攻读学位期间公开发表的论文

博士生期间承担科研项目情况

致谢