Exendin-4通过CaMKK/CaMKIV/PREB通路上调肝细胞中胆固醇运输蛋白ABCA1的表达

摘要

Exendin-4是一种长效的胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide1,GLP-1）激动剂，因其能促进胰岛素分泌被应用于治疗糖尿病。近年来，exendin-4又被证实能够改善肝细胞内脂肪堆积和肝纤维化。脂类运输调节蛋白三磷酸腺苷结合盒转运子A1（ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）已被证实在坦吉尔疾病中存在突变，在脂类运输过程中，对于胆固醇从细胞内向细胞外转运起到了重要的作用；同时又是胆固醇逆向运输（reverse cholesterol transport,RCT）过程中一个非常重要的调节蛋白。研究表明，特异性敲除ABCA1导致胆固醇在肝脏中的大量累积并且打破正常的胆固醇逆向运输。因此，在本论文中我们利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、荧光素酶报告基因系统、基因定点突变系统、siRNA基因沉默系统、染色质免疫沉淀等技术从体内外探讨肝细胞中exendin-4对ABCA1的调节作用，并且深入研究其调节机制。研究结果陈列如下：
　　第一，我们证明了在HepG2细胞中，exendin-4能够在mRNA水平和蛋白水平上调ABCA1的表达。
　　第二，HepG2细胞中有胰高血糖素样肽-1受体的表达。Exendin-4能够刺激该受体的表达，并且进一步在Thr196位点激活钙离子／钙调素依赖的蛋白激酶IV（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV,CaMKIV）和促进CaMKIV分子向细胞核内转运。
　　第三，我们使用荧光素酶报告基因系统证明exendin-4能够增强ABCA1的启动子活性。钙离子／钙调素依赖的蛋白激酶K（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase K,CaMKK）信号通路特异性抑制剂STO609处理或者其下游分子CaMKIV活性位点突变的质粒能够抑制exendin-4对ABCA1启动子活性的增强作用；而CaMKIV的高表达能够显著加强该活性。说明exendin-4是通过CaMKK/CaMKIV信号通路调节肝细胞中ABCA1的转录。
　　第四，胆固醇含量检测结果和油红O染色证实exendin-4显著降低了肝细胞中胆固醇的含量，而且这种作用需要CaMKK信号的激活。
　　第五，在基因库中，我们发现了调节ABCA1基因转录因子：催乳素调节元件结合（prolactin regulatory element binding,PREB）蛋白。使用染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验证实了在肝细胞中，PREB能够结合到ABCA1的启动子区域，并且exendin-4处理能够上调PREB的表达及其向细胞核内转移。
　　第六，在肝细胞中，高表达PREB能够增强ABCA1的启动子活性。突变ABCA1启动子区域的PREB结合位点后，由exendin-4诱导的ABCA1启动子活性增强现象消失。使用siRNA沉默PREB基因的表达减弱了exendin-4对ABCA1的上调作用；沉默CaMKIV基因的表达或者特异性抑制CaMKK信号减弱了exendin-4对PREB和ABCA1蛋白表达的促进作用。由此表明exendin-4通过CaMKK/CaMKIV信号通路调节PREB的表达，进而调节ABCA1基因的转录表达。
　　第七，与普通饮食小鼠相比，高脂肪饮食小鼠肝脏内胆固醇含量高；经腹腔注射exendin-4（1nmol/kg/day,4weeks）能够降低高脂肪喂食的小鼠血清中的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的含量，减少肝脏内的胆固醇积累，激活肝细胞内的CaMKIV信号通路，促进PREB和ABCA1的表达。
　　第八，在成功构建PREB高表达小鼠（PREB-Transgenic mice, PREB-Tg mice）基础上发现：高脂肪饮食条件下，相较于野生型小鼠，PREB基因高表达小鼠血清中的胆固醇和甘油三酯的水平显著降低，肝脏内的胆固醇积累明显减少；同时，肝细胞内ABCA1的表达显著升高。
　　通过体内外实验证实，exendin-4能够通过CaMKK/CaMKIV信号通路促进转录因子PREB的表达，进而上调ABCA1的转录和翻译，起到减少胆固醇在肝细胞中积累的作用。我们的结果表明糖尿病治疗新型药exendin-4和转录因子PREB对于抑制胆固醇在肝脏内的积累以及脂肪肝的预防有潜在的作用。

目录

声明

序言

参考文献

材料和方法

一、材料

二、方法

参考文献

结果

第一部分 Exendin-4通过CaMKK/CaMKIV/PREB通路上调肝细胞中ABCA1的表达

第二部分 Exendin-4或者PREB基因高表达上调小鼠肝脏中ABCA1的表达，进而降低高脂肪食物引起的胆固醇在其中的积累

参考文献

讨论

参考文献

结论

综述:肝病和糖尿病的干细胞疗法研究进展

攻读学位期间发表的论文和所获的奖励

本研究所获基金资助

缩略词表（Abbreviation）

致谢