还原型辅酶Ⅱ对人脐静脉内皮细胞缺糖缺氧复灌损伤早期的保护作用研究

摘要

目的：缺糖缺氧复灌（OGD/R）体外诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的损伤；研究还原型辅酶Ⅱ（NADPH）对损伤后人脐静脉内皮细胞的保护作用，并观察其对蛋白occludin、MMP9、Bcl-2表达的影响。
　　方法：缺糖缺氧复灌（OGD/R）构造人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤模型，将实验分为对照组，缺糖缺氧复灌组,缺糖缺氧复灌+NADPH组三个组。实验分三部分进行，第一部分包括细胞增殖试剂盒（CCK8法）检测细胞活力，细胞毒性试剂盒检测细胞内LDH释放，倒置显微镜记录细胞形态，第二部分包括DHE探针检测胞内ROS，比色法检测SOD、MDA，第三部分包括免疫印迹（Western Blot法）检测细胞内MMP9、occludin、Bcl-2蛋白的表达。
　　结果：
　　1.15mmol/L还原型谷胱甘肽可提高HUVECs活力(1±0.05 vs 1.31±0.0.7,P＜0.05)，高浓度还原型谷胱甘肽可明显提高正常组 HUVECs细胞活力（1±0.05 vs 1.41±0.09，2.11±0.28，P＜0.05）。低剂量还原型谷胱甘肽对缺糖缺氧复灌损伤HUVECs活力无明显影响，高浓度还原型谷胱甘肽可使HUVECs活力明显上升（0.59±0.04 vs 1.01±0.12，1.68±0.19，P＜0.05）。
　　2.大剂量的α硫辛酸可降低正常对照组HUVECs的细胞活力(0.89±0.06,vs0.72±0.07,0.74±0.07,0.65±0.04,0.54±0.06,P＜0.05),各浓度α硫辛酸对缺糖缺氧复灌组HUVECs细胞活力无明显影响(0.52±0.08vs0.46±0.04,0.48±0.06,0.47±0.04,0.49±0.06,0.51±0.04,0.56±0.05,0.58±0.08,0.60±0.03，P＞0.05)3.不同浓度NADPH对正常HUVECs活力无影响（OD值1.02±0.08vs1.06±0.09，1.14±0.10，1.12±0.15，1.12±0.12，1.01±0.08,P＞0.05），缺糖缺氧复灌处理后HUVECs活力明显降低（OD值0.51±0.07vs1.02±0.08， P＜0.05），NADPH可剂量依赖性增加HUVECs活力（OD值0.51±0.07 vs0.53±0.05，0.58±0.07，0.62±0.04，0.68±0.030.68±0.09， P＜0.05）。NADPH有效药物浓度低，使用剂量小，效果优于还原型谷胱甘肽及?硫辛酸。
　　4.NADPH可剂量依赖性降低正常HUVECs中LDH释放（抑制百分率（100±11.99）％vs（95.30±5.96）%，（81.94±10.22）%，（80.39±4.96）%，（72.05±7.98）%，（69.83±8.20）%,P＜0.05），缺血缺氧处理后HUVECs中LDH释放明显增加（（100±11.99）%vs（201.34±15.14）%，P＜0.05），NADPH可剂量依赖性降低细胞内LDH释放（（201.34±15.14）%vs（186.98±16.38）%,（187.23±18.56）%,（176.15±12.17）%,（154.78±12.97）%,（158.46±8.25）%，P＜0.05）。
　　5.缺糖缺氧复灌使HUVECs皱缩，触角伸出，颗粒物增加，NADPH可促进缺血缺氧损伤后HUVECs细胞形态的恢复。
　　6.缺糖缺氧复灌损伤后胞内ROS含量明显增加，予NADPH处理后胞内ROS明显降低。
　　7.缺糖缺氧复灌后HUVECs中SOD活力降低（8.29±0.71U/mg pro vs4.88±0.69 U/mg pro，P＜0.05），NADPH可促进胞内SOD活力恢复（4.88±0.69 U/mg provs6.97±0.46 U/mg pro，P＜0.05）。缺糖缺氧复灌后HUVECs中MDA增加（11.11±1.22 ug/mg pro vs26.73±2.54 ug/mg pro，P＜0.05），NADPH可减少HUVECs中MDA（26.73±2.54 ug/mg provs13.32±2.04 ug/mg pro，P＜0.05）。
　　8.缺糖缺氧复灌后HUVECs中MMP9蛋白表达上调，NADPH处理后可抑制MMP9蛋白上调；缺糖缺氧复灌后HUVECs中occludin蛋白表达明显被抑制，NADPH处理后可促进occludin蛋白的恢复。
　　9.缺糖缺氧复灌后HUVECs中Bcl-2蛋白明显下调，给予NADPH处理后Bcl-2蛋白的下调被抑制。
　　结论：
　　1.NADPH对缺糖缺氧复灌损伤后HUVECs具有保护作用；
　　2.NADPH对HUVECs的保护作用优于还原型谷胱甘肽及?硫辛酸；
　　3.NADPH发挥HUVECs保护作用与抑制损伤后HUVECs内氧化应激反应有关；
　　4.NADPH发挥HUVECs保护作用可能与上调occludin蛋白，抑制MMP9蛋白表达有关，保护紧密连接结构有关；
　　5.NADPH发挥保护作用的机制可能与抗凋亡有关。

目录

声明

引言

第一部分：缺糖缺氧复灌对HUVECs损伤后细胞活力、细胞毒性及细胞形态的影响

材料与方法

实验结果

讨论

第二部分：NADPH对OGD/R引起HUVECs胞内氧化应激的影响

材料和方法

实验结果

讨论

第三部分：NADPH对OGD/R损伤HUVECs细胞occludin、 MMP9及Bcl-2蛋白表达的影响

材料和方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述:occludin蛋白研究进展

中英文对照缩略词表

攻读学位期间公开发表的论文

致谢