黄芪苷Ⅳ对缺氧/复氧诱导人脐静脉内皮细胞释放的微囊泡损伤的离体大鼠胸主动脉环舒张功能的保护作用黄芪苷Ⅳ对缺氧/复氧诱导人脐静脉内皮细胞释放的微囊泡损伤的离体大鼠胸主动脉环舒张功能的保护作用

摘要

缺血的心肌组织在恢复血液灌流后会导致组织损伤加重的情况发生，甚至出现不可逆性的损伤即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。血管内皮损伤后的功能紊乱是心肌I/R损伤的重要组成部分。而血管内皮细胞紧密相连形成介于血液与血管平滑肌之间的屏障，同时可分泌如一氧化氮(Nitric Oxide,NO)等多种活性物质。当I/R损伤发生，血管内皮功能遭到破环，丧失调节NO等相关内皮因子的能力，可能进一步加重I/R损伤。微囊泡(microvesicles,MVs)是细胞在激活或凋亡等多种病理条件下分泌的直径在100-1000nm的微小囊泡。在心肌I/R损伤动物模型中，内皮细胞受损可释放大量的MVs并携带活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)。而在I/R损伤其复杂且精细的发生机制研究中，ROS的生成增多被认为在损伤过程中起到重要作用。在血管内皮功能紊乱和心肌细胞损伤过程中MVs的释放水平提高并可携带ROS。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)经历缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)处理而得到的MVs(H/R-induced endothelial microvesicles,H/R-EMVs)可对H9c2心肌细胞产生十分显著的促凋亡作用且通过增强氧化应激反应损伤离体大鼠胸主动脉环的舒张功能。传统中药黄芪可用于治疗多种心血管系统疾病，黄芪总皂苷是其活性作用部位。黄芪苷Ⅳ(Astragaloside IV,AST)是黄芪总皂苷中分离得到的主要有效成分。研究发现，AST可松弛血管平滑肌导致的H，对于经历缺血损伤的心肌有良好的保护作用。AST可以通过减少ROS的产生，减轻过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)9c2细胞氧化应激损伤。此外，许多研究文献中也证实黄芪苷Ⅳ对于调节血管内皮功能的有益作用。本实验拟通过H/R-EMVs损伤离体大鼠胸主动脉环舒张功能，探讨AST对于H/R-EMVs造成的离体大鼠胸主动脉环舒张功能损伤的影响及其相关机制。 目的： 建立H/R诱导HUVECs的模型，获取H/R-EMVs。H/R-EMVs处理离体大鼠胸主动脉环造成其舒张功能损伤，探究AST对于该损伤的作用及其相关机制。 方法： 1.H/R诱导HUVECs损伤模型的建立 在5%CO2、37?C正常细胞培养环境下，用含10%FBS的DMEM培养HUVECs24h。细胞融合达到约80%后，将培养液更换为缺氧液。HUVECs培养板密封于缺氧装置中，以20L/min的流速向缺氧装置中通入95%N2-5%CO2的混合气。通气15min后，封闭缺氧装置并将其放置在37?C无氧孵箱中培养12h。缺氧环节结束后，打开缺氧装置，取出HUVECs细胞培养板放入正常细胞培养环境复氧培养4h。MTT法检测细胞的存活率，建立H/R诱导HUVECs损伤的模型。 2.H/R-EMVs的两步离心提取、蛋白定量及透射电镜观察 H/R处理HUVECs后，收集培养液，4?C、2700g，离心20min去除细胞碎片；取上清，4?C，33,000rpm，超速离心148min，弃上清，少量D-Hank’s溶液重悬沉淀即为H/R-EMVs悬液，-20?C保存备用。取20μL H/R-EMVs悬液滴于载样铜网上，室温条件下放置2min，待H/R-EMVs悬液充分浸入铜网后，滤纸吸去多余液体。滴入2%的磷钨酸染色液40μL，室温静置2min。白炽灯照射载样铜网使之干燥，透射电镜下对H/R-EMVs进行超微结构观察。 3.内皮完整的离体大鼠胸主动脉环的制备及实验分组 选取Wistar雄性大鼠，体重在240~260g范围内，颈脱臼处死并迅速开胸，获取胸主动脉。将胸主动脉放入盛有4?C的K-H液的培养皿中，使用显微眼科剪小心除去胸主动脉表面的结缔组织后将其剪成3~4mm的胸主动脉环。血管环均在含10%FBS的DMEM中孵育。H/R-EMVs组加入10μg/mL的H/R-EMVs，AST组同时加入10μg/mL H/R-EMVs和10、20、40、60mg/L AST，对照组给予等容量的D-Hank’s溶液。各组在37?C、5%CO2条件下孵育4h。 4.不同浓度ACh介导的离体大鼠胸主动脉环舒张率的测定 将血管环悬挂于预置10mL K-H液的浴槽中，37?C、95%O2-5%CO2，连接离体组织灌流装置和张力传感器。调节预负荷稳定在2g，平衡60min。以10-6mol/L苯肾上腺素(Phenylephrine,PE)激发最大收缩，待收缩幅度稳定后，累积加入终浓度分别为10-9~10-6mol/L的乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)，测定离体大鼠胸主动脉环舒张率。 5.离体大鼠胸主动脉环中NO含量的测定 大鼠胸主动脉环舒张率的测定结束后，选用Griess Reagent试剂检测离体大鼠胸主动脉环中NO的含量。 6.离体大鼠胸主动脉环p-eNOS/t-eNOS、p-Akt/t-Akt及p-ERK1/2/ERK1/2的测定 结果： 1.H/R诱导HUVECs损伤模型的建立 在缺氧12h/复氧4h处理后，显微镜下见HUVECs出现皱缩与变形。与control相比，MTT检测细胞存活率显著降低(74.16%±5.11%vs100%±0%,P＜0.01)，损伤程度适中，实验结果稳定，宜采用该模型诱导HUVECs损伤进行后续实验。 2.H/R-EMVs的分离提取、蛋白定量及超微结构观察 超速离心后，超速离心管底部肉眼可见微量白色沉淀，即为H/R-EMVs。经BCA蛋白试剂检测其含量为0.31±0.02μg/μL。透射电镜下见H/R-EMVs呈直径0.1-1μm的膜性囊泡结构，外形为圆形或椭圆形，表面具有完整的包膜，外部深染区为脂质结构，内部表现为均一浅染区，囊泡内部未见细胞器结构。 3.AST对H/R-EMVs损伤的离体大鼠胸主动脉环舒张功能的影响 在10-9~10-6mol/L的ACh介导下，与control相比，H/R-EMVs使胸主动脉环舒张率显著降低(66.07%±1.78%vs99.67%±5.57%,P＜0.01)。与H/R-EMVs组相比，20、40和60mg/L的AST剂量依赖性的减轻了H/R-EMVs对离体大鼠胸主动脉环舒张功能的损伤（最大舒张率分别为:73.92%±0.61%，85.95%±2.21%，95.51%±4.46%vs66.07%±1.78%，P＜0.01)。AST10组无明显作用(64.93%±0.91%)。 4.AST对H/R-EMVs损伤的离体大鼠胸主动脉环NO含量的影响 与control组相比，H/R-EMVs组NO含量显著降低(56.17±4.31vs84.02±5.12μmol/L,P＜0.01)。与H/R-EMVs组相比，AST20、40和60组剂量依赖性的显著增加NO含量(62.11±3.91,73.37±2.99,81.91±4.15vs56.17±4.31μmol/L,P＜0.05,P＜0.01)。AST10组的NO含量无明显改变(54.78±3.11μmol/L)。 5.AST对H/R-EMVs损伤的离体大鼠胸主动脉环p-eNOS/t-eNOS、p-Akt/t-A kt及p-ERK1/2/ERK1/2含量的影响 与control组相比，H/R-EMVs能够下调离体大鼠胸主动脉环p-eNOS、p-Akt和p-ERK1/2的表达，而不影响t-eNOS、t-Akt和ERK1/2的表达。与H/R-EMVs组相比，40mg/L AST组对t-eNOS、t-Akt和ERK1/2的表达无显著影响，p-eNOS/t-eNOS、p-Akt/t-Akt和p-ERK1/2/ERK1/2的比值显著增加(P＜0.01)。 结论： 1.Q本实验成功建立了缺氧12h/复氧4h诱导HUVECs损伤的模型。 2.Q采用缺氧12h/复氧4h方法诱导HUVECs产生H/R-EMVs，经透射电镜检测证实得到粒径在0.1-1μm且具有囊泡样结构的H/R-EMVs，其蛋白浓度为0.31±0.02μg/μL。 3.Q10μg/mL的H/R-EMVs削弱了离体大鼠胸主动脉环的舒张率，20、40、60mg/L的AST，剂量依赖性的提高了H/R-EMVs损伤的主动脉环的舒张率。 4.Q10μg/mL的H/R-EMVs降低了离体大鼠胸主动脉环的NO含量，20、40、60mg/L的AST，剂量依赖性的提高了H/R-EMVs降低的主动脉环的NO含量。 5.Q40mg/L AST处理组显著提高p-eNOS、p-Akt及p-ERK1/2蛋白的表达，对t-eNOS、t-Akt与ERK1/2的表达无显著性改变。表明AST对H/R-EMVs损伤的胸主动脉环产生保护作用与调节Akt/eNOS与ERK1/2两条重要细胞信号通路相关。

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2015602080-李烨仪-药理学-刘艳霞-黄芪苷Ⅳ对缺氧复氧诱导人脐静脉内皮细胞释放的微囊泡损伤的离体大鼠胸主动脉环舒张功能的保护作用

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