谷氨酰胺tRNA合成酶剪接体QRS-C13相互作用蛋白的筛选研究

摘要

氨酰tRNA合成酶（Aminoacyl-tRNA synthetase ，AARS）是一类催化氨酰化反应的酶,它在蛋白质合成过程中将氨基酸连接到对应的同源 tRNA 上。除了经典功能外，氨酰tRNA合成酶还有许多非经典功能。谷氨酰胺-tRNA合成酶（glutamine tRNA synthetase ,GlnRS,QRS）是氨酰tRNA合成酶中的一种。谷氨酰胺-tRNA合成酶存在一种剪接体 QRS-C13，它缺失了谷氨酰胺-tRNA 合成酶的核心催化结构域，丧失了催化功能。那么 QRS-C13 与哪些蛋白之间存在相互作用？在细胞内QRS-C13 通过什么样的作用机制发挥它的功能？我们通过比较 QRS 和 QRS-C13结合蛋白之间的差异，筛选与QRS-C13特异作用的蛋白，这对了解QRS-C13的功能及其作用机制，发现QRS的非经典功能具有重要意义。 本 研 究 在 Hela 细 胞 中 转 染 重 组 质 粒 pIRESpuro2-QRS-C13 和pIRESpuro2-QRS，通过免疫共沉淀比较发现QRS-C13与QRS的结合蛋白之间存在很大差异，选取差异蛋白进行质谱分析，发现与QRS-C13专一作用蛋白可能是真核翻译起始因子 3 亚基 L(Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit L， eIF3L)，亮氨酰tRNA合成酶（leucyl-tRNA synthetase，LRS）。Western-blot验证QRS-C13 与 eIF3L 之间存在相互作用。通过构建重组质粒 pET20b-QRS-C13， pGEx-4T-2-eIF3L，pGEx-4T-2-LRS，在大肠杆菌中成功诱导表达获得了QRS-C13, eIF3L, LRS蛋白。体外GST-pull down实验发现QRS-C13与eIF3L之间为间接相互作用，QRS-C13与亮氨酰tRNA合成酶（LRS）之间存在直接相互作用，eIF3L与LRS之间存在直接相互作用。由此我们推测QRS-C13与eIF3L之间的相互作用需要LRS的参与，QRS-C13，eIF3L和LRS在细胞中形成复合体执行功能。通过细胞定位实验，发现 QRS-C13主要集中细胞核中，eIF3L主要集中在细胞质中，我们推测 QRS-C13 可能参与细胞核内的相关生命活动。本文的研究结果对QRS-C13的功能研究奠定基础，同时也为QRS的非经典功能研究提供参考。

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第一章 综述

1.氨酰tRNA合成酶

1.1氨酰tRNA合成酶的功能

1.2氨酰tRNA合成酶的分类与进化

2.氨酰tRNA合成酶多酶复合体

3.氨酰tRNA合成酶与疾病的联系

4.谷氨酰胺tRNA合成酶

5.研究内容与意义

第二章 材料与方法

1．实验材料

1.1细胞，菌种，质粒及蛋白

1.2 实验试剂

2．常用实验方法

2.1菌株复苏与保存

2.2 DH5α和Rosetta感受态细胞制备

2.3基因扩增和载体构建相关实验

2.4重组质粒的转化

2.5质粒抽提

2.6切胶回收纯化

2.7质粒浓缩

2.8琼脂糖凝胶电泳

2.9基因测序

2.10聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

2.11目的蛋白的诱导表达与纯化

2.12包涵体蛋白的变复性和纯化

2.13细胞的复苏与冻存

2.14细胞传代

2.15细胞转染与收集

2.16激光共聚焦制片

2.17免疫共沉淀

2.18蛋白银染

2.19质谱分析

2.20 western blot 检测

2.21 GST-pull down

3．主要仪器设备

第三章 QRS-C13特异结合蛋白的筛选

1．实验材料

2．试验方法

2.1真核表达载体的构建

2.2 免疫共沉淀

2.3质谱鉴定与分析

3．结果与分析

3.1 PCR扩增pIRESpuro2-QRS-C13

3.2 免疫共沉淀分离QRS-C13结合蛋白

3.3 质谱鉴定和分析

4.讨论与小结

第四章 QRS-C13相互作用蛋白的鉴定

1．实验材料

2．实验方法

2.1重组质粒的构建

2.2目的蛋白的诱导表达

2.3目的蛋白的纯化

2.4目的蛋白的验证

2.5蛋白体外相互作用验证

3．结果与分析

3.1表达载体pET20b-QRS-C13与pGEx-4T-2-eIF3L的构建

3.2 QRS-C13，eIF3L，LRS蛋白表达与纯化

3.3细胞内QRS-C13与eIF3L之间相互作用的验证

3.4 体外GST-pull down验证蛋白相互作用

4.讨论

第五章 QRS-C13结合蛋白的细胞定位

1．试验材料

2．试验方法

2.1 pEGFP-N1-QRS-C13，pDsRed2-N1-eIF3L质粒构建

2.2目的蛋白的结构预测与分析

2.3激光共聚焦观察显微镜观察细胞定位

3．实验结果

3.1QRS-C13结构预测与分析

3.2重组质粒pEGFP-N1-QRS-C13，pDsRed2-N1-eIF3L的构建

3.3激光共聚焦显微镜观察QRS-C13与QRS的细胞定位

3.2激光共聚焦显微镜观察QRS-C13与eIFL的细胞定位

4. 讨论与小结

第六章 总结与展望

1.总结

2.展望

参考文献

研究生期间科研成果

附 录

致 谢