龙柴方抗HBV作用的临床疗效评价及对ADV耐药变异株敏感性的研究

摘要

龙柴方为南京中医药大学博士生导师金实教授之经验效方，具有清热解毒、调和脾胃的中医功效，临床用治CHB及慢性肝损伤多年，疗效肯定。本课题基于前期龙柴方的临床疗效，以其为研究对象，对相关理论进行归纳、整理和综述分析，进一步从临床角度就龙柴方抗HBV作用进行了疗效的评价，并对其抗HBV耐药、保护肝损伤的作用进行了实验研究，观察了其长期毒性，评价其安全性，为临床应用推广及开发新药提供理论及实验依据。
　　第一部分:理论研究
　　首先从现代医学角度对CHB的发病机理、流行病学、治疗原则及抗HBV药物的应用现状进行了综述，分析认为核苷类药物在抗HBV过程中疗效肯定，但是长期应用存在停药反跳、病毒变异及耐药等弊端，使治疗效果降低。越来越多的研究表明中医药在抗HBV、调节免疫力、抗肝纤维化、改善肝脏炎症及微循环、降酶退黄及改善临床症状和生存质量等方面显示出综合优势。我们分析认为，中西医结合疗法或联合用药可能是未来治疗CHB的重要途径和方法之一。
　　第二部分:临床研究
　　目的:客观评价龙柴方免煎颗粒对CHB的临床疗效。方法:按随机双盲双模拟的临床研究设计，将100例符合诊断标准和入组标准的CHB患者按盲法编码分组，治疗观察结束后揭盲显示，实际观察82例，其中试验组40例，对照组42例（脱落18例，试验组10例，对照组8例，脱落率＜20％）。试验组口服龙柴方免煎颗粒，每日2次，每次总量的1/2，加服苦参素胶囊模拟剂，剂量同对照组;对照组口服苦参素胶囊，每日3次，每次0.2克口服，加服龙柴方免煎颗粒模拟剂，剂量同试验组，疗程12周，观察治疗前后患者中医证候积分、血清ALT、AST、肝功能分度、血清HBeAg、 HBsAg及HBV-DNA定量的变化情况。结果:试验组中医证候改善总有效率92.50％，明显优于对照组的对照组78.57％(P＜0.05);对CHB患者中医主症积分和总积分改善较对照组优势明显(P＜0.05)，对胁肋疼痛、身目发黄、脘腹胀闷的治疗效果亦优于对照组(P＜0.05);两组ALT、AST均较治疗前显著降低(P＜0.05)，但两组间ALT值比较无明显差异(P＞0.05)，而试验组AST降低值优于对照组;两组治疗后肝功能分度、B超检查分度、HBeAg、 HBsAg及HBV-DNA定量值均较治疗前降低，二组间上述指标及总疗效比较虽无显著性差异（P＞0.05），但从数值的变化来看，似乎显示出试验组的优势倾向。结论:龙柴方免煎颗粒在症状学及肝功能改善方面优于苦参素胶囊，对乙肝病毒标志物及病毒载量的抑制作用与苦参素相当，提示龙柴方对CHB患者有一定的疗效。
　　第三部分:实验研究
　　实验一:龙柴方体外抗HBV作用。龙柴方药液作用于HepG2.2.15细胞后，通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞形态和细胞生长周期的影响，通过ELISA检测其分泌HBsAg和HBeAg的变化情况，通过qPCR检测其对细胞内DNA和细胞上清DNA的影响，通过western blot检测其对HBcAg蛋白的影响，实验结果证实龙柴方具有体外抗HBV的作用。
　　实验二:龙柴方体外对ADV耐药株的敏感性研究。通过PCR定点诱变技术构建野生株和ADV耐药株质粒，建立ADV耐药株转染细胞模型，观察龙柴方对瞬时转染的HepG2细胞上清的HBV-DNA、HBsAg表达水平变化以及对细胞HBV-DNA核HBcAg的影响，实验结果证实龙柴方对ADV耐药株有较好的敏感性作用。
　　实验三:龙柴方保护实验性大鼠肝损伤的作用。通过构建CCl4诱导的SD大鼠实验性肝损伤模型，检测给龙柴方药液后大鼠血清肝功能指标(ALT、AST、ALP)、细胞因子指标（TNF-α、IL-6、IL-10）及抗氧化指标（SOD、MDA、GSH-Px、Hyp、组织蛋白）等。实验结果显示龙柴方药液可显著降低实验性肝损伤大鼠血液中的肝功能指标，调节血清细胞因子水平，提高血清中抗氧化指标活性的作用，从而起到保护肝损伤的作用。
　　实验四:龙柴方的安全性评价。通过对SD大鼠进行龙柴方连续给药3个月，观察其毒性试验，结果表明，其大剂量、长时间给药可能对肝、脾、肾脏器有一定的毒性反应。提示:龙柴方在一定剂量范围内使用比较安全，长期大剂量使用会出现毒副作用，主要毒性靶器官为肝、脾、肾。

目录

声明

摘要

前言

参考文献

第一部分 理论研究

1 现代医学对CHB的相关进展

1．1 HBV的生物学特性

1．2 CHB流行病学

1．3 CHB的西医诊断与治疗现状

1．4 抗HBV耐药成为治疗CHB的瓶颈问题

2 龙柴方组方的理论依据及方药功效解析

2．1 龙柴方的组方理论依据

2．2 龙柴方组方药物的传统功效探源

2．3 龙柴方组方药物的现代药理释义

2．4 龙柴方的前期研究成果撷要

参考文献

第二部分 临床研究

1 资料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第三部分 实验研究

1 龙柴方体外抗HBV的作用研究

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

参考文献

2 阿德福韦耐药变异株对龙柴方敏感性研究

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

参考文献

3 龙柴方对CCl4诱导大鼠肝损伤模型的药效学研究

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

参考文献

4 龙柴颗粒大鼠长期毒性实验研究

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

参考文献

结语

附录一 英文缩略词表

附录二 综述 中医药抗乙型肝炎病毒的实验研究进展

附录三 质粒序列

作者简介

致谢