东乡野生稻SRFP1基因鉴定与分析

摘要

东乡野生稻拥有耐旱、耐冷和抗虫病等多种优良性状，含有丰富的种质基因资源，素有“植物大熊猫”之称，在水稻种质改良中具有重要的利用价值。植物蛋白质泛素化降解途径与植物调节胁迫反应紧密相关，E3泛素连接酶是蛋白质泛素化降解途径的关键酶之一，能在转录和翻译水平调节植物的非生物胁迫反应。挖掘和开发东乡野生稻的蛋白质泛素化降解途径关键基因，对于东乡野生稻优良性状机理的研究和有利基因的开发利用具有重要意义。
　　本研究以东乡野生稻为研究材料，从其冬季根cDNA文库中筛选出一个具有完整ORF阅读框的基因SRFP1，783bp，编码一个260个氨基酸的环指E3型蛋白。
　　通过生物信息学分析表明，东乡野生稻蛋白SRFP1和拟南芥的蛋白MIEL1亲缘关系比较近，它们之间蛋白氨基酸序列具有63％的相似性。该基因的启动子顺式元件分析显示，该基因具有ACE（光响应元件），HSE（热应激响应与元件），MSA-like（控制细胞周期的响应元件）以及ABRE(ABA应答元件)等响应元件，很可能接受光的诱导调节、参与植物蛋白代谢、细胞周期调节以及防御和胁迫应激反应过程。
　　为深入研究SRFP1蛋白，构建了pET-28a(+)-SRFP1重组载体并转入大肠杆菌BL21中，诱导表达后经SDS-PAGE电泳检测，得到相对分子量约为29.8 kD的SRFP1融合蛋白。经过进一步的纯化分离，获得高质量活性融合蛋白。蛋白的热稳定研究分析表明该蛋白是热不稳定蛋白。
　　采用RT-PCR技术分析了东乡野生稻SRFP1基因mRNA在不同生长期的根与叶的表达量，结果发现该基因在开花期的表达量最多。进一步分析不同胁迫处理下东乡野生稻三叶期幼苗中该基因的表达量，发现SRFP1基因受冷胁迫、ABA、H2O2、NaCl、PEG6000等的诱导表达，在ABA诱导下SRFP1基因明显增加，是对照的11倍，说明SRFP1蛋白是东乡野生稻ABA依赖的信号通路的效应蛋白。
　　本研究克隆了东乡野生稻SRFP1基因，通过生物信息学分析该基因和蛋白基本特性;原核克隆表达了该SRFP1蛋白，检测表明该蛋白热不稳定;RT-PCR分析表明该基因在东乡野生稻开花期的表达量增多，并受冷胁迫、ABA、H2O2、NaCl、PEG6000等胁迫的诱导表达。在ABA诱导下SRFP1基因明显增加，表示SRFP1蛋白是ABA信号通路的效应蛋白，参与了ABA信号传导。本研究为东乡野生稻的有利基因的开发利用奠定基础。

目录

声明

摘要

缩写名词表

第一章 文献综述

1 绪论

2 植物抗寒性机理的研究

2．1 脱落酸依赖冷信号途径

2．2 非脱落酸依赖冷信号途径

3 东乡野生稻的研究进展

3．1 基因水平探究耐冷性的研究

3．2 东乡野生稻杂交育种的研究

4 泛素蛋白酶体途径的研究

4．1 泛素蛋白酶体途径的组成及其功能特征

4．2 E3泛素连接酶

4．3 E3泛素连接酶在植物抗逆反应中的作用

5 本实验的目的与意义

第二章 东乡野生稻SRFP1的基因鉴定和生物信息学分析

1 试验材料、仪器、试剂

1．1 植物材料

1．2 试验仪器

1．3 试验试剂和配方

2 试验方法

2．1 SRFP1基因的克隆

2．2 东乡野生稻基因SRFP1生物信息学分析

3 结果与分析

3．1 SRFP1的基因鉴定

3．2 东乡野生稻基因SRFP1的生物信息学分析

4 小结

第三章 SRFP1基因的克隆与蛋白的原核表达

1 试验材料、仪器、试剂

1．1 植物材料

1．2 试验仪器

1．3 试验试剂和配方

1．4 菌株和载体材料

2 试验方法

2．1 目的片段PCR

2．2 PCR产物纯化回收

2．3 质粒的碱裂抽提法

2．4 质粒的双酶切反应

2．5 DNA片段的割胶回收法

2．6 双酶切后DNA片段的连接反应

2．7 感受态细胞的制备

2．8 重组DNA的转化

2．9 SRFP1融合蛋白的原核表达

2．10 SRFP1融合蛋白的分离纯化

2．11 SRFP1融合蛋白的热稳定性检测

3 结果与分析

3．1 重组载体pET-28a(+)-SRFP1的构建

3．2 东乡野生稻SRFP1重组基因的原核表达

3．3 SRFP1融合蛋白的分离纯化

3．4 SRFP1融合蛋白的热稳定性研究

4 小结

第四章 SRFP1基因在东乡野生稻中的表达量分析

1 试验材料、仪器、试剂

1．1 植物材料

1．2 试验仪器

1．3 试验试剂和配方

1．4 东乡野生稻不同生育期的根和叶的取材

1．5 东乡野生稻三叶期幼苗的非生物逆境胁迫处理与取材

2 试验方法

2．1 提取植株总RNA

2．2 基因组DNA的清除

2．3 反转录cDNA第一链的合成

2．4 实时荧光定量PCR

3 结果与分析结论与分析

3．1 总RNA的提取

3．2 东乡野生稻不同组织中SRFP1基因的表达分析

3．3 非生物逆境胁迫下SRFP1基因的表达分析

3．4 小结与讨论

第五章 总结与展望

参考文献

附录

致谢