东乡野生稻OsCERK1基因的检测方法和鉴定方法

摘要

本发明公开了一种东乡野生稻OsCERK1基因的检测方法和鉴定方法，涉及作物分子遗传育种学领域。本发明公开的检测方法包括使用SEQ IDNO.1‑2所示的引物进行PCR扩增和使用限制性内切酶对步骤(a)得到的扩增产物进行酶切的步骤。本发明能够准确有效地检测东乡野生稻OsCERK1基因，将其与其他水稻品种来源的OsCERK1基因进行区分，并可对该基因进行分型，为培育和鉴定含有东乡野生稻OsCERK1基因的水稻品种提供了有效的检测和鉴定手段。

说明书

技术领域

本发明涉及作物分子遗传育种学领域，具体而言，涉及一种东乡野生稻OsCERK1基因的检测方法和鉴定方法。

背景技术

野生稻作为栽培稻的祖先，带有多种有利性状基因，是重要的水稻种质资源。东乡野生稻属于普通野生稻，发现于江西省东乡县，是目前世界范围内分布最北的普通野生稻。东乡野生稻含有许多抗寒、抗病虫、耐旱等优良基因，在水稻育种中具有广阔的应用前景。

水稻生长需要肥料提供各种营养物质，但是施用大量肥料不仅增加了生产成本，还会造成环境污染。因此，提高水稻对肥料的利用效率，从而降低肥料的施用量，是水稻遗传改良的一个重要目标。水稻的营养高效除了提高其自身对养分的吸收和转运能力外，还可以通过与土壤微生物的共生来实现。

丛枝菌根真菌(AMF)广泛分布在土壤中，可以与80％的陆生植物共生形成内生菌根，扩大根系吸收面积并增加植物对土壤养分的吸收能力，从而提高养分利用效率。水稻不属于陆生植物，但是也能与AMF共生，只是不同品种之间的共生效率存在较大差异。研究发现从东乡野生稻中克隆出的OsCERK1基因能促进水稻与AMF高效共生，对磷的吸收能力和稻谷产量也显著提高。培育含有东乡野生稻OsCERK1基因(OsCERK1

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种东乡野生稻OsCERK1基因的检测方法和鉴定方法。本发明提供的检测方法和鉴定方法能够准确有效地检测东乡野生稻OsCERK1基因，将其与其他水稻品种来源的OsCERK1基因进行区分，并可对该基因进行分型；本发明为培育和鉴定含有OsCERK1

本发明是这样实现的：

利用常规杂交培育AMF高效共生水稻时，需要根据OsCERK1

水稻中OsCERK1基因变异丰富，涉及启动子区和编码序列，并存在明显的分型。通过发明人的进一步分析和发现，东乡野生稻的OsCERK1基因编码区第851位碱基为T(在栽培稻中为C)，导致在OsCERK1基因编码区碱基第848位至851位，东乡野生稻中序列为GTAT，而其它几乎所有栽培稻中为GTAC；基于此，该突变位点能够作为OsCERK1

基于此，一方面，本发明提供一种东乡野生稻OsCERK1基因的检测方法，其包括：

步骤(a)：对提取自待测样品的核酸模板使用SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增；

步骤(b)：使用限制性内切酶对步骤(a)得到的扩增产物进行酶切，所述限制性内切酶为RsaI；其中，限制性内切酶RsaⅠ的识别序列为GTAC，可以识别所有栽培稻DNA的扩增产物，但无法识别东乡野生稻DNA的扩增产物。

步骤(c)：对步骤(b)得到的酶切产物进行电泳检测。

根据酶切产物片段数量和长度判断是否含有OsCERK1

如果电泳结果显示为一个条带，长度184bp，则指示待测样品为纯合基因型；

如果电泳结果显示为3个条带，长度分别是184bp、133bp和51bp；则指示待测样品为杂合基因型。

如果电泳结果显示为2个条带，长度分别是133bp和51bp；则指示待测样品不含有OsCERK1

本发明提供的检测方法可以用于东乡野生稻与几乎所有栽培稻杂交后代的检测，适用范围广，且出现假阳性的概率很低。该检测方法在检测东乡野生稻与栽培稻杂交F1代时会同时出现双亲的带型，属于共显性标记，能够用于筛选出OsCERK1

该检测方法操作方法简便，无需特殊的试剂和耗材，单个样品的检测成本相比测序分析大幅降低，有利于开展大规模标记辅助选择育种。

上述OsCERK1

atggaagcttccacctccctcctagtcctcgtcctcgccgccgcggcgttcgcggcggggacggtgacggaggcggcgggggacgggtgcagcgccgggtgcgacctcgcgctggcttccttctacgtgacgccgaaccagaacgtcaccaacatggcggatctcttcggcatcggcgcggcgaactaccgcagcctcgcgccctacaacccgaacatccccaacctcgacttcatcaacgtcggcggccgcgtcaacgtctacttcacctgcggctgccgctcgctgccgggctcgccgggagccacctacctcgccggcgccttccccttccagatgtcccgcggccagacctacaccaccgtcgccgccaactacaacaacctcaccaccgccgagtggctgcaggccaccaacagctacccggccaacaacatcccggacaccgccgtcatcaacgccaccgtcaactgctcctgcggcgacgccagcatctcgccggactacgggctgttcctcacctacccgctccgcgccgaggatacgctcgcctccgtcgcggcgacctacgggctctcgtcgcagctggacgtggtcaggaggtacaacccggggatggagagcgccacggggagtggaatcgtgtacatccccgtcaaagatcccaatggaagttacctacctctgaaatcaccaggaaagggagcttctgcaggagctatagcaggaggtgttgtggctggtgtcgttgtgcttgctgccatcttcttgtatatcatattctataggaggagaaaggcaaaacaggccaccctgcttcaatcatctgaagattccacacaacttggtatgatatccatggataaagttaccccatcaacaattgttggcccttcaccagttgcaggcattacagttgacaaatcagtagagttctcatatgaagaactttctaatgctacacaggggtttagtattggcaataaaatagggcaaggtggttttggtgctgtctattatgctgaacttagaggcgagaaagctgccatcaagaaaatggacatgcaggctactcatgagttccttgctgaattaaaggttttgacacatgttcatcatctgaacctggtgcgtttgattggttattgcatcgagagctctttgttccttgtctatgaatttatcgagaatggcaacttgagccagcatttgcgtggaatgggttatgaacctttgtcttgggctgccaggattcaaattgcactagattcagcaagaggtcttgaatacattcatgaacatactgttccagtatacatacatcgggacatcaaatcagcaaacatcttgatagacaagaactaccgggcaaaggttgcagattttggtttaacaaagcttacagaagttggtggtacatcaatgcccacaggcacacgtgttgttggtacatttggttacatgcctccagagtatgctcgatatggagatgtttctcctaaggttgacgtctacgcctttggtgttgtcctctacgaacttatttcagcgaaagaagccatagtcagatcaaccgaatcttcaagtgattcaaaggggctggtttatctgtttgaggaggccctcaactcgccggatcccaaggaaggccttaggacgttgattgatccaaagctaggagaagattatcctattgattccattctcaagctgacacaactcgcaaaggtgtgcacacaagaagaccccaagctgaggccttcaatgagatccgtggtcgtcgcgctgatgacgctttcatccacaagtgagttctgggacatgaacaacctgtatgagaaccaaggtttggtcaacctaatgtccgggagatag。

参照日本晴7.0版本基因组序列该基因在基因组的起始和终止位点分别位于第8染色体的第26909179和26913289位。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸模板为基因组DNA。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述待测样品为水稻。

另一方面，本发明提供一种能与AMF高效共生的水稻品种的鉴定方法，其包括：步骤(a)：对提取自待鉴定水稻样品的核酸模板使用SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增；

步骤(b)：使用限制性内切酶对步骤(a)得到的扩增产物进行酶切，所述限制性内切酶为RsaI；

步骤(c)：对步骤(b)得到的酶切产物进行电泳检测。

根据酶切产物片段数量和长度判断待鉴定水稻样品是否能与AMF高效共生，判断方法如下：

如果电泳结果显示为一个条带，长度184bp，则指示待鉴定水稻样品含有OsCERK1

如果电泳结果显示为3个条带，长度分别是184bp、133bp和51bp；则指示待鉴定水稻样品含有OsCERK1

如果电泳结果显示为2个条带，长度分别是133bp和51bp；则指示待鉴定水稻样品不含有OsCERK1

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸模板为基因组DNA。

另一方面，本发明提供一种东乡野生稻品种的辅助鉴定方法，其包括：步骤(a)：对提取自待鉴定水稻样品的核酸模板使用SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增；

步骤(b)：使用限制性内切酶对步骤(a)得到的扩增产物进行酶切，所述限制性内切酶为RsaI；

步骤(c)：对步骤(b)得到的酶切产物进行电泳检测。

根据酶切产物片段数量和长度判断待鉴定水稻样品是否属于东乡野生稻品种，判断方法如下：

如果电泳结果显示为一个条带，长度184bp，则指示待鉴定水稻样品含有OsCERK1

如果电泳结果显示为3个条带，长度分别是184bp、133bp和51bp；则指示待鉴定水稻样品含有OsCERK1

如果电泳结果显示为2个条带，长度分别是133bp和51bp；则指示待测样品不含有OsCERK1

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述核酸模板为基因组DNA。

可选地，在本发明的一些实施方案中，上述电泳检测采用5％-10％、优选为8％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测。

可选地，在本发明的一些实施方案中，在步骤(a)中，还包括对扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳检测验证片段长度。预期的扩增产物长度184bp，优选使用3％的琼脂糖凝胶电泳检测验证。

另一方面，本发明提供一种核酸片段作为分子标记在辅助培育含有东乡野生稻OsCERK1基因的水稻品种中的应用，所述核酸片段的核酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.3所示的核酸片段覆盖了上述特异突变位点，该核酸片段可以将OsCERK1

另一方面，本发明提供一种东乡野生稻OsCERK1基因的检测试剂盒，其包括第一试剂和第二试剂；所述第一试剂为SEQ ID NO.1-2所示的引物；所述第二试剂为RsaI限制性内切酶。

可选地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括提取水稻基因组DNA的试剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；M：2kb Marker；1：东乡野生稻；2：中早35；3：CSSL-DY；4：F1代(东乡野生稻/中早35)5～13：9个籼稻品种，依次为泰丰B、万象B、赣香占、美特占、R310、R9113、慧茂占、慧占、黄华占；14～23：10个粳稻品种，依次为松粳19、中花11、三江6号、WJ17、WJ126、WJ260、WJ536、CJXJ、QS11、QS74。

图2为实施例1中酶切产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳；M：20bp Marker；1：东乡野生稻；2：中早35；3：CSSSL-DY；4：F1代(东乡野生稻/中早35)5～13：9个籼稻品种；14～23：10个粳稻品种。

图3为对比例1中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；图中，1：东乡野生稻；2：中花11；3：F1代(东乡野生稻/中花11)；4～12：9个籼稻品种，依次为泰丰B、万象B、赣香占、美特占、R310、R9113、慧茂占、慧占、黄华占；13～21：9个粳稻品种，依次为松粳19、中花11、三江6号、WJ17、WJ126、WJ260、WJ536、CJXJ、QS11；M：2kb Marker。

图4为对比例1中酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果；图中，1：东乡野生稻；2：中花11；3：F1代(东乡野生稻/中花11/)；4～12：9个籼稻品种；13～21：9个粳稻品种；M：2kbMarker。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的东乡野生稻OsCERK1基因的检测方法如下：

1水稻基因组DNA提取

待检测的水稻材料有23个，分别为东乡野生稻、中早35、CSSL-DY、F1代(东乡野生稻/中早35)、9个籼稻品种、10个粳稻品种。其中的CSSL-DY是一个以中早35为背景的东乡野生稻单片段代换系，已被证明带有纯合的OsCERK1

(1)取少量叶片剪碎放到2.0ml离心管中，加入600μl 1.5×CTAB和钢珠，在组织研磨仪上以60Hz振荡1min；

(2)将离心管放入65℃水中温浴30min后，加入600μl氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)，轻摇混匀5min；

(3)将离心管12000r/min离心10min，吸取400μl上清液转移到新离心管中；

(4)加入800μl的冰冻95％乙醇，充分混合后在-20℃中静置20min；

(5)将离心管12000r/min离心15min，倒去上清液；

(6)加入500μl的75％乙醇，然后12000r/min离心5min，倒去上清液；

(7)将75％乙醇晾干，加入100μl ddH

2PCR扩增

PCR扩增所用的引物名称和序列如下：

GCX1-F：5’-gaatggaatttcctctgtttc-3’(SEQ ID NO.1)；

GCX1-R：5’-tgccaatactaaacccctgtg-3’(SEQ ID NO.2)；

两引物分别位于OsCERK1基因组DNA序列中从起始位点开始的第2213～2232位碱基和第2376～2396位碱基位置，扩增产物包含了OsCERK1基因组序列中从起始位点开始的第2265位的突变碱基。引物的设计是以扩增产物覆盖特异突变位点为前提，重点考虑酶切产生的片段与原始片段之间长度的差异，使其容易通过电泳分离。GCX1-F的5’端邻近RsaI限制性内切酶的另一个识别位点，不适合前移；3’端邻近一段富含AT的区域，且距离特异突变位点太近，不适合后移。GCX1-R的5’端邻近一段富含AT的区域，不适合前移；在满足引物设计原则的基础上，因此，在其他的实施例中，可适当后移。

东乡野生稻的PCR扩增产物序列(SEQ ID NO.5)和特异突变位点如下：

5’-GAATGGAATTTCCTCTGTTTCTAACATACTACTGTTTTTGTTCCAGCAGGTA

下划线处为突变位点，在东乡野生稻基因组中为T，在栽培稻基因组中为C。

PCR反应体系为10μl，包括：1.0μl的10×buffer，1.0μl的2mM dNTP，0.1μl的10μM正向引物GCX1-F，0.1μl的10μM反向引物GCX1-R，1U的Taq DNA聚合酶和1.0μl的DNA，剩余体积用ddH

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，32个循环后72℃延伸7min。

3琼脂糖凝胶电泳

取100ml的0.5×TBE，加入3g琼脂糖煮沸熔化，自然冷却后制成3％的琼脂糖凝胶。每个PCR反应样品取5μl与2μl的GelRed核酸染料混合，然后点样，以140V电压电泳2h。电泳结束后将凝胶置于UVP凝胶成像系统中观察，可以看到所有的样品中都出现一条184bp的条带(图1)。

4限制性内切酶消化

剩余5μl的PCR反应样品用限制性内切酶RsaⅠ消化，酶切反应体系为10μl，包括5.0μl的PCR反应样品，1.0μl的10×SE buffer，0.5μl的RsaⅠ和3.5μl的ddH

5聚丙烯酰胺凝胶电泳

8％聚丙烯酰胺凝胶的配制成分包括10ml的5×TBE、10ml的40％丙烯酰胺、30ml蒸馏水、500μl的10％过硫酸铵和40μl的TEMED，总体积50ml。各成分按顺序加入后充分搅拌，然后灌胶。待凝胶凝固后取2μl酶切产物点样，以100V电压电泳2h。电泳结束后将胶取下用蒸馏水漂洗2次，再用0.1％的AgNO

从上述结果可以看出，本实施例的方法经过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化和聚丙烯酰胺凝胶电泳后，可以准确检测OsCERK1

对比例1

1水稻基因组DNA提取

待检测的水稻材料有21个，分别为东乡野生稻、中花11、F1代(东乡野生稻/中花11)、9个籼稻品种、9个粳稻品种。中花11为粳稻代表品种，已被证明带有典型的粳稻型OsCERK1基因。水稻基因组DNA采用CTAB法进行抽提，具体步骤参照实施例1进行。

2PCR扩增

PCR扩增所用的引物名称和序列如下：

GCX2-F：5’-accaacatggcggatctctt-3’(SEQ ID NO.3)；

GCX2-R：5’-caagaggaagctgcgaaacct-3’(SEQ ID NO.4)；

两引物分别位于OsCERK1基因组序列中从起始位点开始的第148～167位碱基和665～685位碱基位置，扩增产物包含了OsCERK1基因组序列中从起始位点开始的第353位的突变碱基。该碱基在东乡野生稻和大部分籼稻中为C，未形成限制性内切酶的识别位点；在大部分粳稻中突变为T，形成了限制性内切酶BglⅡ的识别位点(AGATCT)。

PCR反应体系为10μl，包括1.0μl的10×buffer，1.0μl的2mM dNTP，0.1μl的10μM正向引物GCX2-F，0.1μl的10μM反向引物GCX2-R，1U的Taq DNA聚合酶和1.0μl的DNA，剩余体积用ddH

PCR反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，32个循环后72℃延伸7min。

3琼脂糖凝胶电泳

取100ml的0.5×TBE，加入2g琼脂糖煮沸熔化，自然冷却后制成2％的琼脂糖凝胶。每个PCR反应样品取5μl与2μl的GelRed核酸染料混合，然后点样，以140V电压电泳1h。电泳结束后将凝胶置于UVP凝胶成像系统中观察，可以看到所有的样品中都出现一条538bp的条带(图3)。

4限制性内切酶消化

剩余5μl的PCR反应样品用限制性内切酶BglⅡ消化，酶切反应体系为10μl，包括5.0μl的PCR反应样品，1.0μl的10×H buffer，0.4μl的BglⅡ和3.6μl的ddH

5琼脂糖凝胶电泳

采用2％的琼脂糖凝胶电泳，取酶切产物点样，以140V电压电泳2h后将凝胶置于UVP凝胶成像系统中观察。检测的结果为东乡野生稻仅有一个538bp的条带，未出现酶切反应，代表纯合基因型；F1代(东乡野生稻/中花11)出现3个538bp、333bp和205bp的条带，代表杂合基因型；中花11出现2个333bp和205bp的条带，代表阴性的基因型。9个籼稻品种的带型与东乡野生稻相同，9个粳稻品种的带型与中花11相同(图4)。

根据上述结果，可以看出，采用对比例的方法经过PCR扩增、限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳后，可以将粳稻型OsCERK1基因与OsCERK1

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江西省农业科学院水稻研究所

<120> 东乡野生稻OsCERK1基因的检测方法和鉴定方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaatggaatt tcctctgttt c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgccaatact aaacccctgt g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

accaacatgg cggatctctt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caagaggaag ctgcgaaacc t 21

<210> 5

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaatggaatt tcctctgttt ctaacatact actgtttttg ttccagcagg tatgatatcc 60

atggataaag ttaccccatc aacaattgtt ggcccttcac cagttgcagg cattacagtt 120

gacaaatcag tagagttctc atatgaagaa ctttctaatg ctacacaggg gtttagtatt 180

ggca 184

<210> 6

<211> 1875

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggaagctt ccacctccct cctagtcctc gtcctcgccg ccgcggcgtt cgcggcgggg 60

acggtgacgg aggcggcggg ggacgggtgc agcgccgggt gcgacctcgc gctggcttcc 120

ttctacgtga cgccgaacca gaacgtcacc aacatggcgg atctcttcgg catcggcgcg 180

gcgaactacc gcagcctcgc gccctacaac ccgaacatcc ccaacctcga cttcatcaac 240

gtcggcggcc gcgtcaacgt ctacttcacc tgcggctgcc gctcgctgcc gggctcgccg 300

ggagccacct acctcgccgg cgccttcccc ttccagatgt cccgcggcca gacctacacc 360

accgtcgccg ccaactacaa caacctcacc accgccgagt ggctgcaggc caccaacagc 420

tacccggcca acaacatccc ggacaccgcc gtcatcaacg ccaccgtcaa ctgctcctgc 480

ggcgacgcca gcatctcgcc ggactacggg ctgttcctca cctacccgct ccgcgccgag 540

gatacgctcg cctccgtcgc ggcgacctac gggctctcgt cgcagctgga cgtggtcagg 600

aggtacaacc cggggatgga gagcgccacg gggagtggaa tcgtgtacat ccccgtcaaa 660

gatcccaatg gaagttacct acctctgaaa tcaccaggaa agggagcttc tgcaggagct 720

atagcaggag gtgttgtggc tggtgtcgtt gtgcttgctg ccatcttctt gtatatcata 780

ttctatagga ggagaaaggc aaaacaggcc accctgcttc aatcatctga agattccaca 840

caacttggta tgatatccat ggataaagtt accccatcaa caattgttgg cccttcacca 900

gttgcaggca ttacagttga caaatcagta gagttctcat atgaagaact ttctaatgct 960

acacaggggt ttagtattgg caataaaata gggcaaggtg gttttggtgc tgtctattat 1020

gctgaactta gaggcgagaa agctgccatc aagaaaatgg acatgcaggc tactcatgag 1080

ttccttgctg aattaaaggt tttgacacat gttcatcatc tgaacctggt gcgtttgatt 1140

ggttattgca tcgagagctc tttgttcctt gtctatgaat ttatcgagaa tggcaacttg 1200

agccagcatt tgcgtggaat gggttatgaa cctttgtctt gggctgccag gattcaaatt 1260

gcactagatt cagcaagagg tcttgaatac attcatgaac atactgttcc agtatacata 1320

catcgggaca tcaaatcagc aaacatcttg atagacaaga actaccgggc aaaggttgca 1380

gattttggtt taacaaagct tacagaagtt ggtggtacat caatgcccac aggcacacgt 1440

gttgttggta catttggtta catgcctcca gagtatgctc gatatggaga tgtttctcct 1500

aaggttgacg tctacgcctt tggtgttgtc ctctacgaac ttatttcagc gaaagaagcc 1560

atagtcagat caaccgaatc ttcaagtgat tcaaaggggc tggtttatct gtttgaggag 1620

gccctcaact cgccggatcc caaggaaggc cttaggacgt tgattgatcc aaagctagga 1680

gaagattatc ctattgattc cattctcaag ctgacacaac tcgcaaaggt gtgcacacaa 1740

gaagacccca agctgaggcc ttcaatgaga tccgtggtcg tcgcgctgat gacgctttca 1800

tccacaagtg agttctggga catgaacaac ctgtatgaga accaaggttt ggtcaaccta 1860

atgtccggga gatag 1875