斑马鱼视黄醛脱氢酶2基因（raldh2）的启动子活性分析及其受视黄酸调控的反馈抑制机制

摘要

RALDH2是一种在发育时期合成视黄酸(RA)的关键酶。在未分化的体节、肢芽和其他各种器官中都能探测到其基因的表达。RALDH2这种酶不仅合成RA，其表达还受到RA的负反馈抑制。但是，此抑制作用的具体机理仍然还不清楚。前人的研究表明raldh2是RA直接作用的靶基因，而且RA会使raldh2的表达下降。因为raldh2的基础启动子的活性并不是很高，因此本论文将研究重点放在raldh2的第一内含子中。raldh2启动子的细胞转染实验表明RA能直接抑制raldh2的表达。这些数据均说明了RA的合成和降解的过程受到一种反馈抑制机制调节。本论文中，通过生物分析软件发现斑马鱼raldh2基因的启动子上游约2.7kb序列，没有查找到可能的与RA信号通路有关受体转录因子的结合位点，然而在其第一内含子中发现多处可能的与RA信号通路有关受体转录因子的结合位点，即视黄酸反应元件(RAREs)。接下来克隆了这些斑马鱼的raldh2基因的第一内含子片段中RAREs可能密集存在的区域，即第一内含子的自+2109上游片段和第一内含子自+13573到+15115的片段(以raldh2的第一个外显子的的第一个碱基定义为+1位置，其上游第一个碱基为-1)，并将其与raldh2的上游约2.7kb启动子片段一起构成含有报告基因的检测质粒，从而检测这些功能片段对RA的响应能力。通过体内外实验数据发现起着关键性作用的RAREs存在于raldh2的第一内含子中的+13573到+15115的区域中，而且RA信号对raldh2基因的表达调控所呈现的反馈抑制现象可能与N-CoR相关。

目录

文摘

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第一章文献综述

1.1前言

1.2RA结构特征与分布

1.3RA的来源和功能

1.4RA的作用机制

1.5RA受体(RAR)的生化特征及作用

1.6Raldh2的分布及在发育过程中的功能

1.7RA对raldh2基因的表达调控作用

1.8结语

第二章抗斑马鱼视黄酸受体RARα2b抗体的制备

2.1前言

2.2材料与方法

2.3结果

2.3.1斑马鱼视黄酸受体RAR α 2b目标片段的克隆及测序

2.3.2表达载体的诱导表达

2.3.3 Western blot的结果

2.3.4密码子偏性分析

2.4讨论

第三章斑马鱼raldh2的启动子区域与第一内含子片段的克隆

3.1前言

3.2实验方法

3.3结果

3.3.1用生物分析软件进行序列分析

3.3.2斑马鱼基因组DNA的提取：

3.3.3raldh2目标片段的克隆及测序

3.3.4目标片段的克隆及测序

3.4讨论

第四章斑马鱼raldh2的启动子活性分析

4.1前言

4.2实验方法

4.3结果

4.3.1 raldh2基因的启动子对RA有响应

4.3.2 raldh2第一内含子内存在RA信号响应元件调控该基因表达并且raldh2基因中与RA信号响应反应元件在的+13657-+15438 区域

4.3.3RA信号对raldh2基因的反馈抑制的现象在斑马鱼胚胎发育的早期就已呈现

4.3.4受RA信号影响的raldh2基因表达调控可能与N-CoR相关

4.4讨论

参考文献

附录攻读硕士期间参与的工作和取得的成果

致谢