杜仲内生真菌多样性的研究

摘要

内生真菌是指在生活史的某一个阶段存在于健康植物组织内部，不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真菌，是生物多样性的重要组成部分。本论文主要从物种多样性和遗传多样性的角度系统研究了我国特有植物杜仲叶片中内生真菌的生物多样性，同时对内生真菌与其宿主植物遗传分化的相关性问题进行了初步的探索。研究为杜仲内生真菌的遗传资源保护和有应用前景的活性菌株筛选奠定基础，具有重要的生态学意义和潜在的经济价值。
　　本篇论文在我国陕西、河南、湖北、江苏四省选取10个采样点，进行杜仲内生真菌资源调查和多样性分析。研究表明杜仲内生真菌具有丰富的菌群多样性。从杜仲叶片组织中共分离获得内生真菌616株，分离率为1.23，定殖率为83％。其中167株因未产孢暂归为无孢菌群(Sterile mycelia)，占总菌株数的27.11％。能够产生孢子的内生真菌根据形态特征鉴定为18个属。分离频率最高的优势菌群为交链孢菌Alternaria(25.00％)，其次为拟茎点霉Phomopsis(18.67％)、黑腐菌Guignardia(5.52％)和刺盘孢Colletotrichum(5.03％)。不同采样点杜仲的内生真菌定殖率和分离率存在显著差异，范围分别在64％-100％和0.98-1.78之间，均以陕西周至为最低，江苏南京为最高。不同采样点内生真菌种类丰富程度差异很大，陕西略阳的杜仲叶片组织中共分离鉴定出14个属的内生真菌，内生真菌类群最为丰富，而陕西周至则较为单一，仅分离鉴定出6个属。计算了内生真菌菌群的多样性指数，河南南阳和陕西略阳分离获得的内生真菌菌群的Shannon-Wiener物种多样性指数最高，为2.04，陕西周至最低，为1.44。计算了各内生真菌菌群的均匀度指数，范围在0.69-0.83之间，其中以陕西石泉为最低，河南洛阳为最高。10个地点杜仲内生真菌菌群的相似性指数表明地理位置接近，则菌群的相似性较高，反映出内生真菌的定殖可能与地理环境和气候等因素有很大的关系。
　　对分离自杜仲的7株拟茎点霉进行了形态鉴定和ITS序列的亲缘关系分析。利用最大简约法和邻接法分别对这7个内生真菌的ITS序列和其它6条来自GenBank的相关序列进行了分析。结果表明所有的拟茎点霉菌株构成系统进化树的内群，并获得100％的支持率。菌株NY302、BJ188和XA242与杜仲生拟茎点霉P.eucommicola在系统进化树上以较近的遗传距离首先聚类，显示较近的亲缘关系，其余4株菌SY435、LG389、LV286和NJ6独立为一支，与内群中的其余5株拟茎点霉构成姐妹群，显示较远的亲缘关系。形态鉴定结果与ITS序列分析的结论相一致，支持这4株菌独立为一个新的种。
　　探讨了TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2+、引物和模板DNA等因素对ISSR-PCR扩增的影响，通过单因子试验和正交设计方法相结合建立并优化了拟茎点霉ISSR-PCR反应体系。在此基础上对分离自9个杜仲不同地理居群的63株拟茎点霉进行了遗传多样性与遗传分化研究。结果表明，10条引物共检测到120个遗传位点，其中多态位点百分率为99.17％。构建了63株菌的UPGMA聚类图，发现菌株不能完全按其地理来源聚类。居群水平的多态位点百分率平均为56.85％，其中以河南南阳为最高(76.67％)，陕西周至为最低(32.50％)。基于欧氏距离矩阵的AMOVA分析可以看出大多数遗传变异存在于该真菌的居群内。9个居群间的Nei's遗传距离为0.0177-0.2129，平均为0.0980。进行了地理距离与遗传距离的相关性分析，Mantel检测结果显示r=0.08568，说明地理距离与遗传距离之间的相关性为极弱相关。研究还对部分菌株进行了传统的形态学观察与鉴定，综合形态学特征和ISSR分析结果，认为生长速度、分生孢子大小和油球数量等对该属真菌种的划分意义不大，菌落特征、分生孢子形状、载孢体以及腔的形状等是相对稳定的特征，对种的划分有一定的价值。
　　对杜仲内生真菌中的另外一个优势种群刺盘孢也进行了ISSR的遗传多样性和遗传分化研究，结果表明其物种水平具有丰富的遗传多样性(95.65％)。构建的24个刺盘孢菌株的UPGMA聚类图，结果显示不同地点刺盘孢的聚类群与菌株的地理来源呈现一定的相关性，绝大多数来自同一地点宿主的杜仲内生刺盘孢均以较近的遗传距离首先聚类。基于欧氏距离矩阵的AMOVA分析发现群体内和群体间的遗传变异均较为显著。居群间Nei’s遗传距离范围在0.1169-0.5564之间。对地理距离与遗传距离的相关性分析结果显示r=0.1305，说明两者之间的相关性为弱相关。
　　为了探讨宿主植物的遗传分化与其内生真菌的遗传分化是否存在一定的相关性，对10个地理居群共78份的杜仲植物个体材料进行了ISSR的遗传分化研究，将其与杜仲内生刺盘孢和杜仲内生拟茎点霉的ISSR分析结果进行相关性分析，没有发现菌植之间在遗传分化上存在正相关性。
　　文章还探讨了RAPD和ISSR两种分子标记在植物和内生真菌遗传多样性研究中的适用性，认为两者均可以较好的揭示出实验材料间的遗传关系，各有优缺点，只是ISSR的稳定性要优于RAPD，在植物和真菌实验材料中均可以较好的揭示种内遗传差异。

目录

文摘

英文文摘

主要缩略词和符号表

第一章 绪论

1.1 植物内生真菌定义及研究概述

1.2 药用植物内生真菌的多样性

1.2.1 药用植物内生真菌物种多样性

1.2.2 药用植物内生真菌生态多样性

1.2.3 药用植物内生真菌代谢产物多样性

1.2.4 药用植物内生真菌遗传多样性

1.3 内生真菌与宿主植物之间的关系

1.4 杜仲内生真菌的研究进展

1.5 几种常见的DNA分子标记在内生真菌研究中的应用

1.5.1 RFLP限制片段长度多态性

1.5.2 RAPD随机扩增多态性DNA分析

1.5.3 SSR微卫星标记

1.5.4 ISSR简单重复序列间多态性

1.5.5 AFLP扩增片段长度多态性

1.5.6 核糖体基因序列(rDNA)分析

1.5.7 其他常用的分子标记技术

1.6 本论文研究的内容、目的及意义

第二章 杜仲内生真菌资源调查及多样性分析

2.1 材料与方法

2.1.1 供试植物材料

2.1.2 内生真菌分离与保藏

2.1.3 内生真菌鉴定

2.1.4 内生真菌统计及多样性分析

2.2 结果

2.2.1 菌种分离

2.2.2 内生真菌鉴定

2.2.3 不同采样地杜仲内生真菌分布与组成

2.2.4 内生真菌的多样性

2.3 讨论

第三章 杜仲内生拟茎点霉多样性研究

3.1 材料与方法

3.1.1 供试菌株

3.1.2 仪器与试剂

3.1.3 形态学鉴定

3.1.4 实验菌株基因组DNA的提取

3.1.5 ITS序列分析

3.1.6 ISSR-PCR扩增体系的建立与引物筛选

3.1.7 RAPD和ISSR分子标记的比较分析

3.1.8 拟茎点霉遗传多样性的ISSR分析

3.1.9 数据分析指标

3.1.10 数据分析方法

3.2 结果与分析

3.2.1 形态学分析结果

3.2.2 ITS序列分析结果

3.2.3 ISSR扩增体系的建立

3.2.4 RAPD与ISSR分子标记的比较分析

3.2.5 拟茎点霉遗传多样性的ISSR分析

3.3 讨论

第四章 杜仲内生刺盘孢遗传多样性的ISSR分析

4.1 材料与方法

4.1.1 供试菌株

4.1.2 形态鉴定

4.1.3 引物筛选与ISSR-PCR扩增

4.1.4 RAPD与ISSR的比较分析

4.2 结果与分析

4.2.1 形态鉴定结果

4.2.2 杜仲内生刺盘孢物种水平ISSR分析结果

4.2.3 杜仲内生刺盘孢居群水平ISSR分析结果

4.2.4 RAPD和ISSR的比较分析

4.3 讨论

第五章 杜仲的遗传多样性分析

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 植物材料基因组DNA的提取

5.1.3 杜仲ISSR研究方法

5.1.4 杜仲RAPD研究方法

5.1.5 杜仲RAPD与ISSR分析方法的比较

5.1.6 杜仲内生拟茎点霉群体与杜仲群体遗传分化的相关性探讨

5.1.7 杜仲内生刺盘孢群体与杜仲群体遗传分化的相关性探讨

5.2 结果与分析

5.2.1 杜仲ISSR遗传多样性与遗传分化分析结果

5.2.2 杜仲RAPD遗传多样性与遗传分化分析结果

5.2.3 RAPD与ISSR的比较分析

5.2.4 拟茎点霉群体与杜仲群体遗传分化的相关性分析结果

5.2.5 刺盘孢群体与杜仲群体遗传分化的相关性分析结果

5.3 讨论

参考文献

致谢