利用木聚糖产生乙醇的大肠杆菌基因工程菌的构建

摘要

石油作为主要能源和化工原料,为人类社会的发展做出了巨大贡献。但由于大量开采,消耗过快,石油储备日趋减少,现已面临枯竭的地步。因此,寻找新的替代品已成为刻不容缓的战略性问题。燃料乙醇是公认的最有发展前景的可再生清洁能源之一。目前,燃料乙醇的生产主要是以己糖或淀粉质为发酵原料,生产成本偏高,在一定程度上限制了燃料乙醇工业的发展。充分利用植物纤维素中的所有组分,是生产纤维素乙醇的一个关键因素。常用的酿酒酵母和运动发酵单孢菌发酵只能利用葡萄糖,而不能利用植物纤维素类中的其它组分。到目前为止,自然界中尚未发现哪种微生物可以有效的利用植物纤维素代谢产生乙醇。本研究的主要目的就是构建能够利用木聚糖产乙醇的基因工程菌株,为半纤维素类生物质的利用打下基础。
　　 1.Escherichia coli作为模式微生物,发酵产乙醇途径和分子基础研究非常清楚。但是由于野生型的E.coli缺少高活力的乙醇产生酶,厌氧发酵时的主要产物是各种有机酸,乙醇含量非常低。为了提高E.coli代谢产乙醇能力,将运动发酵单孢菌产乙醇代谢途径中的关键酶基因.丙酮酸脱羧酶基因(pdc)和乙醇脱氢酶基因(adhB)整合到E.coli的染色体上。首先克隆运动发酵单孢菌来源的pdc和adhB基因,比较其自身启动子和E.coli来源的启动子对pdc和adhB的表达效果。分别构建pdc和adhB基因的整合载体,利用k-Red同源重组技术将pdc和adhB依次整合到E.coli染色体上的glmS基因位点处。试验结果表明,在厌氧条件下,该基因工程菌产乙醇能力有显著提高,在LB培养基中发酵20 h后,基因工程菌株可产乙醇0.5 g／L。为减少乙醇发酵中副产物乳酸的产生,通过对大肠杆菌的糖酵解以及碳代谢流向的分析,敲除大肠杆菌乳酸脱氢酶,以期减少有机酸的产生。试验结果表明,在厌氧条件下,突变株生长情况明显优于出发菌株,并且在发酵产物中检测不到乳酸的积累。
　　 2.E.coli不具备木聚糖降解酶,为构建能够利用木聚糖的基因工程菌,需引入木聚糖降解酶系中的关键酶一木聚糖酶。Bacillus pumilus ARA是本实验室分离保存,可在以木聚糖为唯一培养基中生长,具有良好的木聚糖降解酶系。首先对B.pumilus ARA来源的木聚糖酶进行克隆、表达及定性。B.pumilus ARA的木聚糖酶(xynA)基因其全长为687 bp,编码228个氨基酸,其蛋白分子量约为23 kDa。对其氨基酸序列分析,翻译后肽链的前21个氨基酸是信号肽组成部分。成功构建了高效表达B.pumilus ARA的木聚糖酶的工程菌株E.coli JM109(pHsh-Bpu-xynAII-His),并对其表达的木聚糖酶进行活性测定。通过Ni-NTA和DEAE-Sepharose FF成功分离纯化出重组的B.pumilus ARA的木聚糖酶,纯化后的重组木聚糖酶条带单一,并且酶比活力大大增强,为纯化前的8.9倍。木聚糖酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.6,在60℃时的半衰期为1小时,金属离子和EDTA对重组木聚糖酶活性没有影响。以燕麦木聚糖为底物的Km值和Vmax分别为5.53mg／ml和116U／mg。利用该木聚糖酶处理木聚糖的产物为低聚木糖和少量的木糖,而与B.pumilus ARA来源的阿拉伯糖苷酶共同水解木聚糖的产物只有木二糖,并且产生少量的木糖和阿拉伯糖。
　　 3.来源于嗜热真菌疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces Ianuginosus DSM5826)的木聚糖酶在较宽的温度和pH范围内都有稳定的活性,并且其水解木聚糖的产物主要为木二糖和木糖。木聚糖是一类由不同种类单糖组成的多聚糖,这类物质由于体积大而无法直接穿过细胞膜进入到细胞里面。因此,在构建利用木聚糖的基因工程菌时,利用大肠杆菌细胞表面展示系统,将木聚糖酶表达到细胞膜外,从而可以直接与底物木聚糖发生作用。首先构建了能在大肠杆菌细胞表面展示木聚糖酶的载体,利用人工合成的sigma70启动子实现木聚糖酶的表达。构建木聚糖酶基因的整合载体,利用λ-Red同源重组技术将木聚糖酶基因整合到E.coli染色体上的glmS基因位点。获得的基因重组菌E.coli M5中木聚糖酶主要表达在细胞外膜表面上,所表达的木聚糖酶酶活占细胞总酶活的84％。通过在含有2％木聚糖的M9培养基中培养该基因工程菌株,结果显示E.coli M5在以木聚糖为单一碳源的培养基中有微弱的生长。
　　 4.由于木聚糖是高度分支的多糖,完全降解木聚糖需要木聚糖酶和相关酶系的共同作用。β-木糖苷酶可以将木寡糖和木二糖分解为木糖。将嗜热厌氧菌来源的木糖苷酶整合到E.coli中,使重组菌可以表达木糖苷酶,从而更充分的利用木聚糖。首先构建了能在大肠杆菌周质空间表达木糖苷酶的载体,利用E.coli的强启动子PompA实现木糖苷酶的表达。构建木糖苷酶基因的整合载体,利用λ-Red同源重组技术将木糖苷酶基因整合到E.coli染色体上的glmS基因位点。获得的基因重组菌E.coli M6中木糖苷酶主要表达在细胞周质空间内,所表达的木糖苷酶酶活占细胞总酶活量的62％。通过在含有2％木聚糖的M9培养基中培养该基因工程菌株,结果显示E.coli M6能够在以木聚糖为单一碳源的培养基中生长,说明在E.coli中已经成功构建了木聚糖降解酶系。对所构建的乙醇工程菌(E.coli M6)进行木聚糖发酵实验的结果表明,E.coli M6在含有4％木聚糖的M9基本培养基中,发酵40小时的乙醇终产量达1.1 g／L。