黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因工程菌的构建、高效表达及重组酶性质研究

摘要

背景：
　　木聚糖酶(Xylanase)[EC3.2.1.8]在木聚糖降解过程中作用非常重要，能够将木聚糖降解为木糖和低聚木糖。其在环境、食品、饲料、能源、造纸等行业均有广泛的应用。产木聚糖酶的微生物分布很广，不同来源以及不同种类的木聚糖酶具有不同的催化特性，使用各种手段来提高木聚糖酶的产量并降低其生产成本，是亟待解决的问题。
　　目的：
　　构建木聚糖酶毕赤酵母基因工程菌，优化工程菌产酶条件，实现木聚糖酶的高效表达;分析重组酶的酶学性质，为木聚糖酶的工业应用提供理论依据。
　　方法：
　　1.毕赤酵母工程菌构建
　　将A.niger XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2和xynZF-3重组到真核表达载体pPIC9K上，线性化后，分别电击转入毕赤酵母GS115和KM71中，G418初筛、摇瓶复筛出4株木聚糖酶高产菌株。
　　2.工程菌发酵条件的优化
　　对重组菌产酶的接种时间、诱导温度、发酵培养起始pH、甲醇诱导浓度、诱导时间等进行单因素优化，在此基础上进行正交和响应面综合试验。
　　3.重组酶酶学性质的分析
　　测定重组酶的最适作用温度、最适作用pH、热稳定性、pH稳定性以及金属离子和EDTA对酶的影响，通过薄层层析分析重组酶的水解产物，测定重组酶的动力学常数。
　　结果：
　　1.成功构建4种木聚糖酶工程菌，分别命名为GS115/pPIC9K-2、GS115/pPIC9K-3、KM71/pPIC9K-2、KM71/pPIC9K-3，并成功实现异源表达。
　　2.得到4株菌的最优发酵条件，GS115/pPIC9K-2:甲醇浓度1.0％，接种时间31h，诱导时间104 h，诱导温度30℃、发酵起始pH值4.0;KM71/pPIC9K-2:甲醇浓度2.0％，接种时间26 h，诱导时间132 h，诱导温度30℃、发酵起始pH6.2;GS115/pPIC9K-3:甲醇浓度2.0％，接种时间24 h，诱导时间108 h，诱导温度30℃、发酵起始pH6.3;KM71/pPIC9K-3:甲醇浓度1.75％，接种时间26 h，诱导时间132 h，诱导温度30℃、发酵起始pH6.5。验证性实验结果比酶活力分别为36523.2 U·mg-1、8654.28 U·mg-1、139.36 U·mg-1、143.29 U·mg-1。
　　3.酶学性质分析结果如下:GS115/pPIC9K-2最适作用温度和pH分别是45℃和6.0;KM71/pPIC9K-2最适作用温度和pH分别是45℃和5.5;GS115/pPIC9K-3最适作用温度和pH是45℃和5.0; KM71/pPIC9K-3最适作用温度和pH是40℃和5.0;Ca2+、Fe2+和EDTA对重组酶有不同程度的促进作用，Fe3+、Mn2+、Cu2+对重组酶具有明显的抑制作用。这4种重组木聚糖酶在温度50℃以下，pH5-7范围内酶活力相对稳定。
　　4.薄层层析结果显示，重组酶XynZF-2水解桦木木聚糖的产物为:木二糖和五糖。
　　5.4种酶的动力学常数为:km分别为1.5 mg·L-1、1.25 mg·L-1、3.56 mg·L-1、3.04mg·L-1,Vmax分别为2500μmol·mL-1·min-1、2680μmol·mL-1·min-1、1368μmol·mL-1·min-1、1589μmol·mL-1·min-1。
　　结论：
　　黑曲霉XZ-3S菌株来源的2种木聚糖酶基因，在毕赤酵母GS115和KM71中成功实现异源表达。发酵条件优化后，毕赤酵母工程菌的产酶量远远高于原核细胞中的表达量，重组酶热稳定性和pH稳定性优于原核表达重组酶。

目录

声明

摘要

前言

1．1 木聚糖酶的结构、性质及应用

1．2 基因重组技术在木聚糖酶研究方面的应用

1．3 木聚糖酶发酵的实验室操作方法

1 材料与方法

1．1 菌株和质粒载体

1．2 试剂和主要试剂的配制

1．3 主要仪器

1．4 培养基

1．5 引物设计及合成

1．6 重组表达载体pPIC9K-xynZF的构建

1．7 重组表达质粒pPIC9K-xynZF的线性化及纯化

1．8 毕赤酵母GS115及KM71电转化感受态细胞的制备

1．9 酵母细胞的电击转化

1．10 毕赤酵母高拷贝的筛选

1．11 重组毕赤酵母工程菌株的摇瓶培养及诱导表达

1．12 重组毕赤酵母工程菌表达产物的分析

1．13 相关标准曲线的绘制及计算公式

1．14 统计学分析

1．15 发酵条件优化

1．16 重组酶的纯化

1．17 酶学性质分析

2 结果与分析

2．1 木聚糖酶基因的扩增

2．2 真核重组表达载体pPIC9K-xynZF的构建

2．3 重组表达质粒的大量提取及线性化

2．4 酵母的电击转化和筛选

2．5 毕赤酵母工程菌发酵条件的优化

2．6 SDS-PAGE分析

2．7 重组木聚糖酶酶学性质分析

3 讨论

4 结论

参考文献

综述 木聚糖酶基因克隆和表达的研究进展

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢

个人简历