粟酒裂殖酵母核糖体蛋白RPL32-2的基因转录调控因子筛选研究

摘要

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的核糖体蛋白RPL32的两个同源蛋白RPL32-1和RPL32-2在功能上既有类似可以相互替代的方面，同时也存在功能的分化。本实验室在前期研究中发现，RPL32-1，-2这两个同源蛋白在细胞不同生长阶段具有不同表达以及不同的生理意义，当RPL32的总蛋白量保持不变时，同源基因相互竞争抑制另一个同源基因的表达;当细胞处于沉默状态时，RPL32-1高表达抑制细胞分裂;而细胞处于对数期时，RPL32-2呈现高表达促进细胞分裂。然而RPL32-1，RPL32-2为什么会在不同时期有不同的表达量？产生这样功能分化的原因是什么呢？由此本文开展了RPL32-2转录调控因子的研究。
　　我们首先利用酵母单杂交技术对rpl32-2的启动子的转录因子进行筛选。本研究构建了高质量的酵母cDNA文库，利用构建的带有rpl32-2启动子的诱饵菌株，从cDNA文库中筛选可能的rpl32-2转录因子，共获得109个阳性克隆。对获得的阳性克隆cDNA序列分析，经过NCBI比对得出了43种可能的结合蛋白，通过统计学分析，出现频率较高的可能的结合蛋白有6种，其中有五种核糖体蛋白RPS6-1，RPL5-2，RPS10-1，RPL27-1，RPL5-1以及一种翻译延伸因子EF1B，其出现频率分别为11.93％，11.93％，8.26％，6.42％，5.50％，11.01％。推测这些蛋白有可能是rpl32-2的转录因子。
　　为验证上述假说，我们通过构建pGADT7+ rps6-1，pGADT7+rps10-1，pGADT7+rpl5-1，pGADT7+rpl5-2，pGADT7+rpl27-1，pGADT7+ef1b重组质粒，通过再转化实验进一步验证，结果发现RPL5-1，RPL5-2，RPS6-1均可能与rpl32-2的启动子产生相互作用。我们得出结论RPL5-1，RPL5-2，RPS6-1都有可能是rpl32-2的转录因子。但由于单杂交实验本身存在一定的局限性，存在假阳性的可能，所以我们需要通过其他的验证实验。
　　本文针对rpl32-2启动子与核糖体蛋白RPL5-1之间有无相互作用，通过染色质免疫共沉淀实验(ChIP)从体内进行验证。我们首先构建带有RPL5-1-HA标签的酵母菌株，利用HA抗体进行染色质免疫共沉淀，以ChIP的纯化产物为模板进行PCR扩增，但并没有从中扩增出rpl32-2启动子DNA片段。所以我们得出结论，rpl32-2的启动子与RPL5-1蛋白之间没有相互作用，之前的单杂交实验结果为假阳性。
　　至于利用酵母单杂交筛选得出的其余的rpl32-2的启动子的可能结合蛋白也需要进一步验证。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 核糖体蛋白的相关研究

1．1．1 核糖体蛋白研究的历史及其意义

1．1．2 核糖体蛋白功能的研究

1．1．3 RPL32同源基因的不同功能和差异表达的相关研究

1．2 转录调控因子相关的研究进展

1．2．1 转录调控因子的结构

1．2．2 转录因子调节基因转录的机制

1．3 启动子DNA结合蛋白研究策略

1．3．1 酵母单杂交技术

1．3．2 DNA迁移率变动试验(DNA mobility shift assay，EMSA)

1．3．3 染色质免疫共沉淀实验

1．4 本文研究目的与内容

第2章 从粟酒裂殖酵母的cDNA文库筛选RPL32-2启动子的结合蛋白

2．1 构建cDNA文库

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 实验结果

2．1．4 讨论

2．2 单杂交筛选RPL32-2启动子的转录因子

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．2．3 实验结果

2．3 本章讨论

第3章 酵母单杂交技术初步确定RPL32-2启动子的转录因子

3．1 酵母的再转化实验

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．1．3 实验结果

3．2 点圈实验验证RPS6-1，RPL5-1，RPL5-2与rpl32-2启动子有无相互作用

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 实验结果

3．3 本章讨论

第4章 ChIP-PCR验证RPL32-2核糖体蛋白启动子与RPL5-1相互作用关系

4．1 构建带有PRL5-1-HA标签的酵母菌株

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．1．3 实验结果

4．2 ChIP-PCR验证rpl32-2启动子与RPL5-1相互作用

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．2．3 实验结果

4．3 本章讨论

第5章 全文总结

参考文献

在读期间发表的学术论文及研究成果

致谢