灰盖鬼伞菌盖多糖水解酶的分离纯化、鉴定及生理功能研究

摘要

真菌多糖水解酶的研究有很多报道，其中很多水解酶都参与了其菌丝或子实体的自溶。对于自溶已经有了深入的认识，从最初认为的是在恶劣环境条件下细胞死亡的过程，到现在普遍认为的有着精密复杂调控机制的具有重要生理功能的过程，对真菌的生存、孢子形成和传播等都有重要意义。但关于真菌自溶的机理还需要更加深入的研究。担子菌特别是其中的伞菌，在子实体成熟后都有快速的自溶现象，所以我们以一种模式真菌灰盖鬼伞为研究对象，从其中多糖水解酶对细胞壁结构的水解作用角度，阐释真菌自溶的机理。
　　本文以灰盖鬼伞为研究材料，用硫酸铵盐析、阴阳离子交换层析、高效液相色谱层析的方法，从灰盖鬼伞菌盖中分离纯化出一系列具有β-1，3-葡聚糖酶活性的葡聚糖酶和一个外切几丁质酶。质谱分析鉴定结果表明，这几种葡聚糖酶分别为胞外β-糖苷酶、外切-β-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖β-1，3-糖苷酶和糖苷家族16蛋白，然而经过底物特异性和作用方式分析结果显示，它们实际分别为β-糖苷酶、β-1，3-糖苷酶、外切-β-1，3-葡聚糖酶和内切-β-1，3-葡聚糖酶。底物特异性结果表明胞外β-糖苷酶不是专一的β-1，3-糖苷水解酶，对β-1，3/1，4/1，6糖苷键都能水解。用薄层层析色谱方法分析三种β-1，3-糖苷水解酶与昆布多糖的水解产物，结果表明这三种β-1，3-糖苷水解酶发挥协同水解作用:内切-β-1，3-葡聚糖酶昆布多糖内部的糖苷键产生各种长度的β-1，3-寡糖，外切-β-1，3-葡聚糖酶再将较长链的寡糖水解为短链的二糖、昆布二糖和龙胆二糖，最后β-1，3-糖苷酶水解昆布二糖产生葡萄糖。残留的龙胆二糖还需要其它β-1，6-糖苷酶来水解，胞外β-糖苷酶可能就在此发挥水解作用。因此，我们推测在灰盖鬼伞子实体自溶过程中β-1，3-糖苷酶、外切-β-1，3-葡聚糖酶和内切-β-1，3-葡聚糖酶协同作用降解细胞壁的β-1，3-葡聚糖骨架。此外，这三种β-1，3-糖苷水解酶的最适pH和最适温度都相同，分别为5.0和60℃，说明它们可能在相同的条件下工作，也从侧面支持了上述协同作用的推测。同时从灰盖鬼伞菌盖中用硫酸铵盐析和弱阳离子交换色谱层析的方法，分离纯化得到的一种具有几丁质酶活性的蛋白，经过质谱鉴定为V型几丁质酶ChiB1。底物特异性和离子色谱层析分析表明ChiB1为一种外切几丁质酶。ChiB1的最适pH为5.0，最适温度为35-40℃，以胶态几丁质为底物的Km和Vmax分别为2.63mg ml-1和2.31μmol min-1 mg。ChiB1水解灰盖鬼伞碱不溶细胞壁多糖的产物中含有大量的可溶性β-葡聚糖，因此，我们认为几丁质酶ChiB1通过水解细胞壁多糖中的几丁质链从而暴露出大量的β-1，3或β-1，6葡聚糖非还原末端或者直接释放出β-1，3或β-1，6葡聚糖分子，与β-葡聚糖酶协同作用降解细胞壁促进菌盖的自溶，在子实体自溶中具有重要意义。通过对灰盖鬼伞子实体葡聚糖酶和几丁质酶生理功能的研究，我们认为葡聚糖酶和几丁质酶都参与子实体的自溶，外切几丁质酶ChiB1（可能还有其他几丁质酶，如自溶中同样高表达的Ⅲ类几丁质酶）水解细胞壁的几丁质结构，暴露出更多的葡聚糖，配合葡聚糖酶水解葡聚糖结构;而葡聚糖酶BGL1、EXG和ENG协同作用，降解β-1，3-葡聚糖成分。葡聚糖酶和几丁质酶共同水解细胞壁，从而使子实体完全自溶。本研究是对真菌自溶机制具有重要意义的探索，为其提供了重要的参考价值。真菌自溶机制的研究对抗真菌药的研制、抗真菌转基因植物等的研究具有重要意义。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 真菌细胞壁的结构和功能

1．1．1 细胞壁葡聚糖的结构及类型

1．1．2 细胞壁几丁质的结构及类型

1．2 真菌多糖水解酶功能的研究

1．2．1 真菌葡聚糖酶

1．2．2 真菌几丁质酶

1．3 真菌自溶的研究

1．3．1 自溶的分子机制及生理功能

1．3．2 与自溶相关的生理代谢

1．3．3 真菌自溶的影响条件

1．4 本论文的研究目的和主要研究内容

第2章 灰盖鬼伞菌盖中β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化、鉴定及其生理功能研究

2．1 材料和方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 培养基及试剂

2．1．3 灰盖鬼伞子实体的培养和菌盖的收集

2．1．4 葡聚糖酶的提取和分离纯化

2．1．5 蛋白质分析

2．1．6 酶的水解活性测定

2．1．7 温度和pH对酶活性的影响

2．1．8 酶的反应动力学参数的测定

2．1．9 薄层色谱分析

2．2 实验结果

2．2．1 葡聚糖酶的纯化

2．2．2 酶的鉴定

2．2．3 底物特异性和酶的作用方式

2．2．4 酶的协同作用

2．2．5 酶的最适pH和最适温度和反应动力学参数

2．3 讨论

第3章 灰盖鬼伞菌盖中一种外切几丁质酶的分离纯化、鉴定和生理功能研究

3．1 材料和方法

3．1．1 实验材料和培养方法

3．1．2 几丁质酶的提取和分离纯化

3．1．3 蛋白质分析

3．1．4 几丁质酶的水解活性测定

3．1．5 温度、pH对酶活性的影响

3．1．6 金属离子对几丁质酶活性的影响

3．1．7 几丁质酶反应动力学参数的测定

3．1．8 灰盖鬼伞不同时期菌盖中基因组的所有几丁质酶的mRNA表达水平分析

3．1．9 几丁质酶对碱不溶细胞壁多糖的水解作用

3．2 实验结果

3．2．1 几丁质酶ChiB1的纯化及特性

3．2．2 几丁质酶ChiB1酶学性质分析

3．2．3 几丁质酶ChiB1的生理学功能分析

3．3 讨论

第4章 全文总结

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文

致谢