重组工程法敲除恶臭假单胞菌KT2440和谷氨酸棒状杆菌ATCC13032染色体基因

摘要

重组工程(Red/ET, recombination mediated genetic engineering)是指通过重组酶催化DNA分子之间的同源重组而实现DNA克隆和DNA修饰一种基因工程手段，是一种新型高效的遗传工程技术。其中的重组酶主要是λ噬菌体中redαβ基因表达的蛋白和Rec前噬菌体中的recET表达的蛋白。利用重组工程从理论上可以完成对多种细菌及真菌中染色体DNA的敲除及修饰，而且通过重组工程可以避免其他基因敲除方法中要构建克隆的步骤，直接进行OE-PCR(Overlapextension PCR，重叠延伸PCR)即可获得重组片段。此种方法最先在大肠杆菌中实现，现在经过完善已逐渐在其他细菌及真菌中实施。本课题中的恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)是在生物降解及异源表达中有重要作用的环境微生物，谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(Corynebacterium glutamicumATCC13032)是在工业中发酵生产各种氨基酸的菌株。随着这两种菌株全基因组测序的完成，对其基因功能的研究越来越深入。基因敲除是研究基因与蛋白质关系的重要手段，通过重组工程介导的基因敲除可以实现两种菌的高效基因敲除。
　　本文介绍了不同系统的重组工程方法分别对P.putida KT2440和C.glutamicum ATCC13032进行染色体基因敲除。对P.putida KT2440进行基因敲除中共涉及了一种双质粒系统和三种单质粒系统，只有双质粒Cre/loxP系统和一种由丙酮诱导的Cre/loxP单质粒系统完成了四种基因的无标记敲除。具体方法是制备含有能够表达相关重组酶基因的质粒的P.putida KT2440电转感受态细胞，将通过OE-PCR获得的重组片段转入到电转感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素抗性的平板上进行筛选，在双质粒系统中，验证正确后，制备电转感受态细胞，转入含有cre基因的质粒，进行抗性基因的敲除，在此系统中目的基因的无痕敲除效率最高可以达到100％;在单质粒系统中，第一步的同源重组效率只能达到双质粒系统的1/5，推测可能与Cre酶的高本底水平表达有关，得到卡那霉素抗性菌株后直接接入含有丙酮的培养基中进行诱导培养一代即可消除抗性基因，虽然敲除效率达不到双质粒系统的效率，但是操作更加方便简洁且适合于高通量操作。对C.glutamicum ATCC13032进行基因敲除中，构建了redαβ和 recET两种重组酶表达载体，其上包含有同源重组所需的各种重组酶基因，以及双链断裂修复过程中需要的Ⅰ-SceⅠ基因，具体方法是制备含有能够表达相关重组酶基因质粒的C.glutamicum ATCC13032电转重组感受态细胞，将通过OE-PCR获得的重组片段转入重组感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素的抗性平板上进行筛选，通过PCR进行验证，获得含有卡那霉素抗性基因的重组目的菌株。随后进行Ⅰ-SceⅠ介导的双链断裂修复系统进行第二次同源重组消除抗性基因。用redαβ系统完成了crtI2和upp两种基因的敲除，用recET系统完成了crtI2、upp和cgp3三种基因的敲除以及fasR基因中丝氨酸(AGT)到天冬酰胺(AAT)的点突变实验。但结果尝试了多种方法仍未实现Ⅰ-SceⅠ介导的抗性基因敲除，进一步的实验还在进行中。

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名词缩写

摘要

第一章 综述

1 恶臭假单胞菌KT2440

1．1 概述

1．2 研究进展

2 谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032

2．1 概述

2．2 研究进展

3 重组

3．1 基因重组

3．2 同源重组

4 重组工程

4．1 重组工程机理

4．2 重组工程研究进展

5 定点突变

第二章 重组工程和Cre／loxP介导的恶臭假单胞菌KT2440无标记基因敲除

第一节 双质粒系统对P. putida KT2440染色体基因的无标记敲除

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

第二节 两种单质粒Cre／loxP重组系统对P. putida KT2440染色体基因的敲除

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

第三节 一种mekR-PmekA单质粒诱导表达的Cre／loxP重组系统对P. putida KT2440染色体基因的敲除

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

第四节 Cre／lox66-lox71系统介导的P. putida KT2440染色体基因的敲除

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

第三章 重组工程法敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032染色体基因

第一节 redαβ和recET两种重组系统质粒的构建及对谷氨酸棒状杆菌基因敲除的效率比较

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第二节 recET系统敲除大片段基因及点突变实验

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

第三节 消除neo抗性基因的不同诱导质粒的构建

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 分析与讨论

总结

参考文献

致谢

科研成果