恶臭假单胞菌KT2440的重组工程法基因敲除

摘要

重组工程(Red/ET，recombination mediated genetic engineering)是一种基于噬菌体同源重组系统的重组技术。Red/ET重组就是λ噬菌体的Red蛋白组合Redα/Redβ/Redγ)或Rac前噬菌体的RecE/RecT蛋白介导的同源重组。通过重组工程方法理论上可以对细菌基因组任意大小的DNA片段进行敲除和修饰，重组工程的优点由于是利用PCR所获得的DNA片段进行转化，省略了基因克隆步骤，因而简便、快速而高效。研究证实，重组工程方法可以用于多种细菌和真菌，这个方法首先在大肠杆菌中构建出来，随后推广应用到曲霉、耶尔森菌、沙门氏菌和志贺氏菌等微生物中。
　　恶臭假单胞菌KT2440是在生物降解环境有机物和表达异源基因等方面很具重要作用的环境微生物。基因敲除是研究基因和蛋白的功能和构建具不同生物学活性菌株的必需手段。常规的基因敲除手段往往需要繁琐耗时且易引入突变的基因克隆操作。
　　本文报道了一种利用重组工程对Pseudomonas putida KT2440(P.putidaKT2440)进行基因敲除的方法，首先本课题研究了利用重组工程方法对KT2440菌株进行基因敲除的可行性，实验的做法是，通过OE-PCR扩增获得带有同源臂的卡那霉素抗性基因的DNA片段，诱导KT2440表达Red重组酶并制成感受态细胞，将以上获得的DNA片段电转入上述的感受态细胞，利用卡那霉素抗性平板筛选。实验表明，重组工程方法能在恶臭假单胞菌菌株中发挥高效作用；为了实现无冗余的基因敲除，本课题已经尝试了四环素抗性基因tet作为可消除正负筛选抗性标记的可行性以及基于Cre位点特异性重组酶的抗性消除体系，实验表明，四环素抗性基因不能用作KT2440的可消除抗性标记，而基于Cre位点特异性重组酶抗性消除体系能够高效发挥作用而消除抗性片段，具体的做法是由PCR获得含同源臂和loxP位点的neo基因盒整合至基因组正确位点。获得的带有卡那霉素抗性基因的敲除菌株通过诱导Cre重组酶的表达促使细胞发生分子内重组，从而实现只残留一个loxP位点的基因敲除。本课题还将尝试基于归巢内切酶I-SceI双链断裂修复实现完全无冗余的基因敲除。
　　此实验方法用来实现恶臭假单胞菌KT2440快速高效的基因敲除，为KT2440功能基因组学研究提供一种有效方法。

目录

文摘

英文文摘

名词简写

第一章 文献综述

1 恶臭假单胞菌KT2440

1.1 恶臭假单胞菌KT2440的概述

1.2 恶臭假单胞菌KT2440研究进展

2 重组

2.1 DNA重组

2.2 同源重组的分子机制

3 重组工程及应用

3.1 重组工程及其原理

3.2 重组工程的应用

4.无冗余碱基基因敲除研究概况

第二章 恶臭假单胞菌KT2440的重组工程法基因敲除

1 实验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 培养基和缓冲液的配制

1.3 主要工具酶及化学试剂

1.4 主要仪器设备及来源

1.5 引物合成与测序

2 实验方法

2.1 常规分子生物学操作方法

2.2 重组酶表达质粒

2.3 P.putida KT2440与重组酶诱导表达的P.putida KT2440/pLS512电转化感受态细胞的制备和DNA的转化

2.4 pLS512从重组菌株中的消除

3 结果

3.1 重组工程法对P.putida KT2440基因敲除的策略

3.2 PP 3948基因敲除

3.3 PP 3948基因敲除条件的优化

3.4 PP 1384-PP 138.87.3 kb片段的敲除

3.5 PP 2064-PP 20699.3 kb片段的敲除

4 讨论

第三章 抗性消除实验

1 实验材料

1.1 菌种和质粒

1.2 培养基和缓冲液的配制.

1.3 主要工具酶及化学试剂

1.4 主要仪器设备及来源

1.5 引物合成与测序

2 实验方法

2.1 常规分子生物学操作方法

2.2 利用Cre重组酶消除抗性片段的方法

3 结果

3.1 利用四环素抗性基因作为KT2440无标记敲除筛选标记的实验

3.2 P.putida KT2440基于Cre位点特异性重组酶消除体系实验

3.3 P.putida KT2440基于归巢内切酶I-SceI双链断裂消除抗性基因实验

4.讨论

本文总结

参考文献

附录

致谢