RNA干扰抑制马立克氏病毒繁殖的研究

摘要

本文针对MDV-1RBIB株UL49基因序列(编码被膜蛋白VP22)寻找siRNA靶序列，根据siRNA阴性对照设计原则设计相应的阴性对照。经BLAST验证，所选择的靶序列与鸡体和其他病毒基因片段无同源性。在设计的靶序列5'端开始的19个核苷酸为正义链，中间加入9个核苷酸TTCAAGAGA的间隔以形成发夹结构，3'端加有转录终止信号TTTTTT。并且5'端带有BamHⅠ(GATCC)酶切位点，3'端带有SalⅠ(GTCGAC)和HindⅢ(TTCGA)酶切位点。靶序列分别被克隆到psilence2.0-U6载体上。经SalⅠ酶切鉴定和测序鉴定后，证明已成功地构建了针对UL49基因不同区域的shRNA(smallhairpinRNA)表达载体。同时根据Ambion公司已发表的针对加强绿色荧光蛋白(EGFP)的siRNA序列构建了相应的阳性对照载体pu6EGFP。　　以提取的MDV-1RBIB株病毒基因组DNA为模板，根据GeneBank上发表的MDVMd5株UL49基因序列设计1对特异性引物，扩增出UL49(750bp)基因，克隆到pMD18-TSimpleVector。目的片段经双酶切连接到pEGFPC1载体上，构建了pEGFP-vp22融合表达载体。经转染CEF细胞，分别在24h，48h，72h观察荧光的变化。PEGFP-vp22与构建的针对UL49基因不同区域的shRNA表达载体分别两两共转染CEF细胞后，分别在24h，48h，72h观察荧光的变化。在此基础上以内标法进行相对定量RT-PCR(反转录聚合酶链反应)，在mRNA水平上来验证这些shRNA表达载体的有效性。　　选取能有效抑制MDV1型超强毒RB1B株的被膜蛋白VP22的shRNA表达载体—pu6vp22-4，通过转染CEF细胞后，再接种超强毒RB1B株，通过蚀斑数的比较来验证RNA干扰(RNAinterference，RNAi)能否有效抑制MDV蚀斑的形成。在此基础上进一步观察pu6vp22-4抑制MDV蚀斑的形成的动态效应、剂量效应、以及CEF细胞感染MDV-1超强毒株RB1B前、后作为预防制剂和治疗制剂的效果。

目录

文摘

英文文摘

前言

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第一篇文献综述

第一章马立克氏疾病及其研究现状

1 MD的发生发展

2 MD发病机理

3 MDV的基因组

4 MDV毒力的进化

5 MD疫苗

6 小结

参考文献

第二章RNA干扰的研究进展

一 RNA干扰的机理

二 RNA干扰在哺乳细胞中的研究

三RNA干扰技术方面的研究

四 RNAi的应用

五小结

参考文献

第二篇实验部分

第三章shRNA表达载体的构建

摘要

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第四章shRNA有效抑制MDV-1被膜蛋白VP22的表达

摘要

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

第五章shRNA对马立克氏病病毒增殖的抑制作用

摘要

前言

1材料

2方法

3结果

4讨论

参考文献

全文总结

致谢

附录