双孢蘑菇培养料二次发酵过程中的细菌群落结构研究

摘要

“后发酵”是双孢蘑菇(Agaricusbisporus)培养料制备工艺中的关键技术，通过室内控温的堆肥过程，可以进一步促进培养料成为有利于蘑菇菌丝吸收、利用的“选择性”栽培基质。在这一过程中，各种嗜热微生物的生理代谢和群落衍替发挥了至关重要的作用，本试验运用PCR-DGGE(DenaturingGradientGelElectrophoresis，变性梯度凝胶电泳)和ARDRA(AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis，核糖体DNA的限制性片段长度多态性分析)分析相结合的现代分子生态学方法，对“后发酵”期间双孢蘑菇培养料内的细菌群落结构进行了初步的研究： 1.对于高有机含量的培养料样品，微生物总DNA的提取采用了较为温和的细胞裂解法(化学破壁结合生物酶解)，高盐浓度(1.1MNaCl)的细胞裂解液中加入PVPP，结合PEG-8000进行DNA沉淀，能有效地减少腐殖酸等杂质的污染，提取的DNA可直接用于限制性酶切和PCR扩增。 2.对取自“后发酵”不同时期的七份培养料样品，特异性扩增细菌16SrDNA的V3可变区，用于DGGE分离。V3-DGGE图谱显示整个“后发酵”过程中细菌的群落结构发生了明显的变化，且与“后发酵”的生产工艺相对应，细菌的衍替情况可大致分为四个时期，分别以C1、C3、C6和C7样品为代表。针对该四份样品，建立细菌16SrDNA全长文库，ARDRA分析的结果同DGGE一致，以上四个文库的16SrDNA组成均以各自独有的酶切类型为主。DGGE和ARDRA方法相互验证说明利用现代分子生态学的方法能快速、准确地对培养料发酵过程中的微生物群落结构进行动态的检测。 3.对DGGE图谱中的主要条带和ARDRA文库中的优势类群进行序列测定，序列分析的结果均显示：培养料中的细菌组成要远远丰富于人们用传统的分离方法所获得的类群，“空气调节”时期的培养料中不仅检测到了前人用经典培养方法获得的Bacillus属嗜热细菌，还发现了一些未曾报道的Bacilli门的成员，如Trichiococcus属、Planococcus属和Caryophanon属，以及γ-Proteobacteria亚纲。而在“后发酵”刚开始和即将结束的培养料中分别检测到了Thermusthermophilus和α-Proteobacteria亚纲的细菌，这些是近年来利用分子生物学方法在各类高温堆肥中发现的新类群；更为重要的是在整个“后发酵”过程中还发现了大量目前尚未获得培养的细菌类群。可见，DGGE和ARDRA方法的应用不仅可以对传统的研究结果进行验证，更为重要的是极大地拓宽和加深了人们对堆肥这一复杂生境中的微生物的认识。 对双孢蘑菇培养料中的微生物区系进行研究有助于人们更深入地了解堆肥发生的机理，从而更好地实现对其工艺的控制和优化；本试验是分子生态学方法在该研究领域的一次尝试，结果显示PCR-DGGE的应用能直观、灵敏地反映整个“后发酵”过程中的微生物衍替情况，若能将DGGE电泳图谱与其所代表的微生物类群及其功能结合起来，考察DGGE图谱和发酵料质量好坏的相关性，就有可能为培养料的质量控制提供崭新的思路，即建立分子指标。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号及缩略语说明

原创性声明及学位论文版权使用授权书

第一章文献综述

第二章材料与方法

第三章结果与分析

第四章讨论

参考文献

附录文中所用试剂与培养基配方

致谢

攻读硕士学位期间所发表文章