大豆种子贮藏蛋白亚基特异种质的筛选、鉴定及其遗传稳定性与功能性研究

摘要

本研究以1400份大豆品种为材料，在筛选到蛋白亚基特异种质的基础上，进行了亚基含量年份问稳定性分析、亚基缺失类型的进一步鉴定和遗传分析以及种质创新、亚基特异种质的蛋白功能性评价等方面的研究。以期为进一步发掘我国丰富的大豆基因资源、筛选出亚基组成优良的大豆材料，明确亚基变异类型遗传规律，阐明亚基变异对大豆蛋白功能性的影响奠定基础。主要结果如下： 1、1400份参试品种的11S／7S比值范围为0.44～3.64，平均值为1.68±0.37，鉴定出34份亚基含量特异材料，其中包括α′和α亚基含量低、β亚基含量低、A<,3>B<,4>亚基缺失、A<,5>A,,4>B<,3>亚基缺失和A<,1a>B<,1b>亚基缺失种质。理化诱变结果表明：化学诱变率为2.92％，物理诱变率为5.71％，对大豆蛋白的诱变效果0.4％EMS处理优于0.2％EMS处理，而<'60>Co γ射线慢照射处理优于化学诱变处理。并从M<,3>代种子中筛选出了211粒亚基变异种质。 2、分析了2003年、2004年和2005年种植的280份大豆种质的7s和11S组分及其亚基含量间的差异，结果表明：品种对大豆贮藏蛋白7S、11S组分及其亚基含量、7S+11S和11S／7S值的影响均达极显著水平，年份除对α亚基和A<,4>亚基含量的影响达极显著水平外，对其它亚基含量及7S、11S、7S+11S和11S／7S值的影响均不显著；品种×年份对7S、11S、11S／7S值、α亚基、A<,4>亚基和A<,5>亚基含量的影响达极显著水平，对其它组分和亚基含量的影响均不显著。 3、在SDS-PAGE筛选到蛋白亚基特异种质的基础上，运用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)分析大豆贮藏亚基正常品种南农大黄豆和亚基变异品种桂阳紫金豆种子总蛋白的蛋白质组。差异蛋白质组学显示，等电点和分子量分别约为5.40和37.85 kDa、5.24和37.2 kDa、5.15和37.05 kDa的蛋白质点在正常品种种子中表达而在缺失品种中未表达。对这3个蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其胶内酶解后的肽质量指纹谱(PMF)，对获得的PMF用Mascot软件在NCBI数据库中查询比对，鉴定出这3个蛋白质点均为大豆球蛋白A<,1a>B<,1b>亚基同源三聚体，表明桂阳紫金豆种子贮藏蛋白缺少A<,1a>b<,1b>亚基。 4、研究了4个不同蛋白亚基类型(A<,1a>B<,1b>亚基正常、A<,1a>B<,1b>亚基缺失； A<,3>B<,4>亚基正常、A<,3>B<,4>亚基缺失)的品种所配成的6个杂交组合的F<,1>、F<,2>、F<,3>种子亚基表现及其遗传。结果表明：A<,1a>B<,1b>亚基、A<,3>B<,4>亚基正常分别受一对显性基因控制，A<,1a>B<,1b>亚基、A<,3>B<,4>亚基缺失分别受一对隐性基因控制，控制A<,1a>B<,1b>亚基、A<,3>B<,4>亚基正常的基因分别对控制A<,1a>B<,1b>亚基、A<,3>B<,4>亚基缺失的基因均表现为完全显性，其F<,2>的分离均符合3：1的遗传比例。同时，利用聚合杂交方法，在缺失A<,1a>B<,1b>亚基、A<,23>B<,4>亚基和A<,5>A<,4>B<,3>亚基单株间及其分离后代间进行杂交，经SDS-PAGE检测表明：获得了5份缺失A<,1a>B<,1b>亚基、A<,3>B<,4>亚基和A<,5>A<,4>B<,3>亚基的创新种质。5、为明确提取分离大豆贮藏蛋白11S和7S两种主要组分的最适方法，采用凯氏定氮和SDS-PAGE分析，从浸提液种类、提取液pH值、浸提次数和温度、料液比、Tris-HC1浓度和还原剂种类等影响提取分离效果的因素着手，综合Nagano法和Thanh法两者的优点，对提取分离方法进行了进一步的改进。结果表明：浸提液采用pH8.5、含0.01m01／L亚硫酸氢钠的0.03～0.06m01／L Tris-HCl缓冲液系统，提取温度45℃，料液比1:15，重复浸提两次；分离过程中，在pH6.4沉淀离心分离出11S组分、调pH5.5沉淀离心分离出中间产物后，再调pH值至4.8沉淀离心分离出7S组分。优化后的方法显著提高了11S和7S组分的得率、蛋白含量和纯度。 6、以5个具遗传稳定性的蛋白亚基变异类型大豆品种(系)制备的分离蛋白和南农大黄豆粗7S蛋白为材料，对其溶解性、凝胶质构特性、乳化性和乳化稳定性以及DSC特性进行了测定。结果表明：在溶解性方面，11S组分单个亚基缺失对大豆蛋白的溶解性没有显著影响。在凝胶质构特性方面，A<,3>B<,4>亚基缺失、11S组分含量显著降低对凝胶质构特性影响显著；7S组分含量与凝胶弹性呈显著正相关；11S组分含量与凝胶硬度、胶粘性和破裂强度呈显著正相关，与凝胶内聚性呈极显著正相关，与凝胶弹性呈极显著负相关；11S／7S值与凝胶硬度、内聚性和胶粘性均呈显著正相关，与凝胶弹性呈极显著负相关。在乳化性和乳化稳定性方面，11S组分单个亚基缺失对乳化性和乳化稳定性影响不显著，11S组分含量显著降低或缺失对乳化性和乳化稳定性影响显著。在热稳定性方面，粗7S蛋白和M11SR所制分离蛋白变性温度和变性焓较低，单个亚基缺失的四个品种所制分离蛋白变性温度和变性焓较高且相近。

目录

文摘

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第一章 文献综述

第二章 大豆种子贮藏蛋白亚基含量变异种质的筛选与创制

第三章 品种和年份对大豆种子贮藏蛋白主要组分及其亚基含量的影响

第四章 利用差异蛋白组学技术鉴定大豆贮藏蛋白A1aB1b亚基的缺失

第五章 大豆种子贮藏蛋白A1aB1b和A3B4亚基缺失的遗传分析及缺失基因的聚合

第六章 大豆种子贮藏蛋白11S和7S组分提取和分离方法的优化

第七章 大豆种子贮藏蛋白亚基特异种质的蛋白功能性评价

本文结论和进一步的工作展望

参考文献

附录

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