两种生防活性蛋白Harpin和AiiA的表达及生物活性检测

摘要

农药伴随人类改造自然、征服自然已有一百多年的历史，在植物保护中发挥了巨大的作用，促进了农业发展，给人类带来了巨大的经济效益。然而使用农药所引起的副作用，如：病虫草产生抗药性、对非靶标生物的直接毒害、对环境的污染等，已成为了农业生产上迫切需要解决的问题。二十世纪70年代基因工程技术的出现，为解决这些问题提供了新的途径与思路。 Harpins是革兰氏阴性植物病原细菌通过Ⅲ型泌出系统分泌的一类能诱导非寄主植物过敏反应和系统获得抗性的非特异性蛋白激发子。本研究采用PCR方法从水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzicola，Xooc)RS105菌株中扩增harpin<,Xooc>编码基因hrf2，将其克隆到酵母表达载体pPICZαA的分泌信号肽基因下游，获得重组表达质粒pPICZαA-hrf2。重组表达质粒线性化后电击转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌X-33，经抗生素Zeocin筛选和PCR鉴定后，得到重组酵母菌X-33/pPICZαA-hrf2。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白，发酵上清液经浓缩后进行SDS-PAGE电泳分析，在约18 kD处有特异目标条带出现。Westem Blot检测表明表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明酵母重组表达蛋白harpin<,xooc>能够诱导烟草产生过敏反应和促进烟草生长，活性高于在大肠杆菌中表达的harpin<,Xooc>。 aiiA基因编码的N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)水解酶(AiiA蛋白)能降解细菌产生的AHLs信号分子，干扰该信号分子参与细菌群体感应的调控过程，抑制多种植物病原菌致病基因的诱导表达，从而减轻或消除病原菌的致病性。本实验根据已报道的aiiA基因序列设计引物，从枯草芽胞杆菌中成功扩增出一段长为753 bp的序列，测序后经blast比对，结果表明与已发表的aiiA基因序列相似性均在85％以上。将此基因克隆到pET30(a)表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，超量表达的蛋白在菌体中以包涵体形式存在；AiiA蛋白经SDS-PAGE电泳检测，表达产物分子量为28 kD。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一篇文献综述

第一章外源基因表达系统研究进展

1原核表达系统

2真核表达系统

3总结

第二章细菌群体感应系统及其应用

1细菌QS系统

2细菌群体感应的应用

3总结

第二篇研究内容

第三章HarpinXooc蛋白在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性检测

摘要

引言

1材料和方法

2结果与分析

3结论与讨论

第四章枯草芽孢杆菌aiiA基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

摘要

引言

1材料和方法

2结果与分析

3结论与讨论

参考文献

攻读学位期间发表论文

致谢