AiiA蛋白的表达和生物活性检测

摘要

aiiA (N-acyl-homoserine lactonase，aiiA)基因编码的AiiA蛋白可以破坏植物病原细菌产生的信号分子N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)信号分子，干扰该信号分子介导的群体感应，减弱致病菌对植物产生的危害。
　　 构建携带N-酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA)的重组毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-aiiA，采用电转化方法导入毕赤酵母GS115，经营养缺陷型培养基、表型鉴定和高G418浓度筛选获得高拷贝表达盒的酵母转化子，用0.5[％]甲醇诱导表达，RT-PCR鉴定可检测到重组酵母中编码目的基因成熟肽的mRNA，SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明，aiiA基因在毕赤酵母中成功表达，用指示菌紫色杆菌CV026检测发现目的蛋白具有降解N-酰基高丝氨酸内酯的活性。
　　 构建了分泌型表达载体pPIC9K-aiiA，SacⅠ酶切后，将其转化到毕赤酵母GS115，经过营养缺陷型培养基、表型鉴定和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子重组酵母菌GS115(pPIC9K-aiiA)，目的菌株用甲醇诱导后，上清未见有目的蛋白条带出现，浓缩后的上清也没有活性，报告菌检测胞内蛋白提取物存在活性。
　　 将aiiA基因克隆到表达载体pET28a构建重组表达载体pET28a-aiiA，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，0.8mM IPTG诱导，SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明，实现了aiiA基因在大肠杆菌中的表达，报告菌检测目的蛋白AiiA具有很好的降解AHLs的活性。