抗重金属镉、铅单克隆抗体、单链抗体的研制及单链抗体三维结构的模建

摘要

重金属是一类很危险的污染物，在生物体内长期积累不可降解，在极其微量的情况下也会产生不良后果。各种生态系统都不同程度受到重金属的影响。重金属通过食物链沉积到人体中，可引起各种疾病甚至癌症，危害还能遗传到下一代。因此重金属在环境、农产品中残留监测都是非常重要的。 本文旨在建立能稳定分泌高亲和力、高特异性抗重金属镉和铅单克隆抗体的杂交瘤细胞株，在对其亲和力、特异性进行鉴定的基础上，建立其免疫分析方法并得到初步应用，克隆抗重金属镉、铅单克隆抗体的重链和轻链可变区基因，构建抗重金属单链抗体基因，在大肠杆菌中诱导表达，并对表达产物进行初步鉴定，利用计算机平台和软件进行模拟分析抗镉的单链抗体(SeFv)三维结构。重金属离子通过双功能螯合剂与血蓝蛋白的偶联物作为免疫原，免疫BALB/c鼠。采用杂交瘤技术建立能稳定分泌高亲和力抗重金属镉、铅单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量制备并经盐析、蛋白亲和层析获得纯化的单克隆抗体，间接ELISA法检测效价，非竞争酶免疫实验测定亲和力，竞争ELISA法测定抗体的特异性。采用矩阵实验确定抗原抗体的最佳组合，通过对离子强度、pH值、封闭物等影响因子的研究，确定酶联免疫吸附分析(ELISA)的最佳工作参数，建立定量测定金属离子的间接竞争ELISA方法。在此基础上，选择杂交瘤细胞株，用Trizol试剂提取总RNA，通过RT-PCR，采用小鼠重链可变区和轻链可变区通用引物，扩增抗体可变区基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将两个可变区基因通过连接肽基因连接起来，构建单链抗体基因，克隆到pGEM-T Easy载体中，通过酶切、PCR和测序进行鉴定。然后用限制性内切酶双酶切pGEM-metal-ScFv质粒和pET-30a(+)质粒，构建pET-metal-ScFv重组表达质粒。转化大肠杆菌BL21(DE3)后，筛选阳性菌株，通过酶切、PCR进行鉴定。阳性菌株经IPTG诱导培养后，分离包涵体，进行变性和复性处理，通过SDS-PAGE和竞争抑制ELISA对表达蛋白的分子量和活性进行初步鉴定。在SWISS-MODEL软件服务器上，利用同源蛋白结构预测的方法模建单链抗体分子结构，建立其三维结构模型，运用分子生物学、分子动力学，验证三维结构的合理性。成功建立了七株能稳定分泌抗镉和铅单克隆抗体的杂交瘤细胞株，获得了高纯度的单克隆抗体，蛋白浓度达1.58-5.0mg/mL，Aa6为IgG1亚类，其余的均为IgM亚类，亲和力达10<'8>-10<'10>L/mol，选亲和力高的抗体建立标准曲线，抗体Aa6和4/7的IC<,50>分别为4.19μg/L和2.72μM，镉和铅的最低检出重金属镉、铅单克隆抗体、单链抗体的研制及抗体可变区三维结构的模建浓度分别为0.313μg/L和0.056μM，自来水、超纯水等水样中重金属标准液的添加回收率为80-114％。从杂交瘤细胞中成功地扩增出重链和轻链可变区基因，采用重叠延伸PCR获得约750bp大小的单链抗体基因，并克隆到T载体。经测序证实，轻重链可变区基因均在300bp左右，轻重链之间是由45bp连接肽基因连接。然后，成功地将抗金属ScFv基因按设计的VH-linker-VL方向插入表达载体pET-30a(+)，转化大肠杆菌，阳性茵落经ITPG诱导后，表达出目的蛋白，目的蛋白主要以包涵体形式存在，经变性和复性处理，可获得分子量大约29KD的蛋白但亲和力不是很高，抑制率不超过10.6％。获得抗体的分子结构模型，单链抗体的轻、重链联系精密且位置得当，并可分析H链CDR3区主要的抗原结合位点。重金属镉、铅单克隆抗体Aa6和4/7能有效地用于实验室水样的重金属镉和铅残留检测。从杂交瘤细胞株扩增抗体可变区，成功构建了抗金属镉和铅单链抗体基因，在大肠杆菌获得了功能性表达，为进一步开展以抗重金属ScFv为基础的研究奠定了基础，抗体三维模型的建立为进一步分析轻、重链在抗体功能中的作用，为改造抗体、提高抗体活性等方面提供了一种途径。

目录

文摘

英文文摘

声明

上篇文献综述

第一章文献综述

1重金属污染及污染状况

2重金属的危害

3重金属残留分析技术

4重金属检测的发展方向

5重金属免疫分析法

6本论文研究目的和意义

参考文献

下篇研究内容

第二章抗镉单克隆抗体、单链抗体的研制及抗体可变区三维结构的模建

第一节重金属镉单克隆抗体的制备及其ELISA方法建立

第二节抗镉单克隆抗体可变区基因的克隆、单链抗体基因的构建和鉴定

第三节镉ScFv在大肠杆菌的表达和初步鉴定

第四节抗镉单链抗体(ScFv)三维结构的同源模拟

第三章抗铅单克隆抗体、单链抗体的研制和鉴定

第一节抗铅单克隆抗体的制备及鉴定

第二节铅单克隆抗体检测方法的建立

第三节抗铅抗体可变区基因的克隆、单链抗体基因的构建和鉴定

第四节铅ScFv在大肠杆菌的表达和初步鉴定

第四章全文总结、创新点及后续研究展望

1全文总结

2创新点

3不足

4后续研究展望

附录

致谢