重金属铜单克隆抗体研制及铜、汞单链抗体三维结构模拟

摘要

重金属是有毒并对环境有着持久污染的物质，重金属可以在生物体内长期积累不可降解，在环境中可长时间结合在土壤或沉淀物中，随着环境的变化使金属发生移动，大大提高了它们的毒性和可吸收性。因此重金属在环境、农产品中残留检测都是非常重要的。
　　 本研究制备抗重金属铜杂交瘤细胞株，在对其亲和力、特异性进行鉴定的基础上，克隆抗重金属铜、汞单克隆抗体的重链和轻链可变区基因，构建抗重金属单链抗体基因，利用软件分析抗铜和抗汞单链抗体(ScFv)二级结构和三维结构。
　　 铜离子通过双功能螯合剂与血蓝蛋白(KLH)的偶联物作为免疫原，免疫BALB/c鼠。采用杂交瘤技术建立能稳定分泌高亲和力抗重金属铜单克隆抗体的杂交瘤细胞株，大量制备获得纯化的单克隆抗体，间接ELISA法检测效价，非竞争酶免疫实验测定亲和力，竞争ELISA法测定抗体的特异性。确定抗原抗体的最佳组合，通过对离子强度、pH值优化等研究，确定酶联免疫吸附分析(ELISA)的最佳工作参数，建立定量测定金属离子的间接竞争ELISA方法。
　　 选用Trizol试剂提取总RNA，通过反转录PCR(RT-PCR)利用重链可变区和轻链可变区通用引物，扩增抗体可变区基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将两个可变区基因通过连接肽基因连接起来，构建单链抗体基因，克隆到T载体中，通过PCR和测序进行鉴定。
　　 在Discovery Studio软件服务器上，利用同源蛋白结构预测的方法模建单链抗体分子结构，建立其三维结构模型，运用分子生物学、分子动力学，验证三维结构的合理性。
　　 采用杂交瘤技术建立能稳定分泌高亲和力抗汞单克隆抗体的杂交瘤细胞株，选用汞单克隆抗体30，用Trizol试剂提取总RNA，通过RT-PCR，采用小鼠重链可变区和轻链可变区通用引物，扩增抗体可变区基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将两个可变区基因通过连接肽基因连接起来，构建单链抗体基因，克隆到pGEM-T载体中，通过酶切、PCR和测序进行鉴定。
　　 在Discovery Studio软件服务器上，利用同源蛋白结构预测的方法模建单链抗体分子结构，建立其三维结构模型，运用分子生物学、分子动力学，验证三维结构的合理性。
　　 成功建立了三株能稳定分泌抗铜单克隆抗体的杂交瘤细胞株，获得了高纯度的单克隆抗体，选亲和力高的抗体建立标准曲线，抗体DF4的IC50分别为0.671μg/mL,铜最低检出浓度为0.014μg/mL，自来水、超纯水等水样中重金属标准液的添加回收率介于为81.8-111.5％。从抗铜杂交瘤细胞DF4和抗汞杂交瘤细胞30中成功地扩增出重链和轻链可变区基因，采用重叠延伸PCR获得约750 bp大小的单链抗体基因，分别克隆到T载体和pGEM-T载体中。经测序证实，轻重链可变区基因均在300 bp左右，轻重链之间是由45 bp连接肽基因连接。获得两种抗体的分子结构模型，单链抗体的轻、重链联系精密且位置得当，并可分析重链CDR3区主要的抗原结合位点。

目录

文摘

英文文摘

上篇 文献综述

第一章 重金属污染及危害

1 重金属铜污染及危害

2 重金属汞污染及危害

第二章 重金属抗原和抗体制备技术研究进展

1 重金属人工抗原的设计与合成

2 重金属抗体制备技术

第三章 重金属残留分析技术

1 光学分析法

2 电化学分析法

3 色谱分析法

4 其他分析法

5 生物传感技术

第四章 重金属免疫分析技术

1 荧光免疫技术

2 放射免疫分析技术

3 酶联免疫分析技术

4 发光免疫分析技术

参考文献

下篇 研究内容

第一章 抗铜单克隆抗体、单链抗体的构建及可变区三维结构模拟

第一节 重金属铜单克隆抗体的制备及鉴定

第二节 铜单克隆抗体检测方法的建立

第三节 抗铜单克隆抗体可变区基因的克隆、单链抗体基因的构建和鉴定

第四节 抗铜单链抗体(ScFv)三维结构的同源模拟

第二章 抗汞单链抗体的构建及可变区三维结构模拟

第一节 抗汞单克隆抗体可变区基因的克隆、单链抗体基因的构建和鉴定

第二节 抗汞单链抗体(ScFv)三维结构的同源模拟

第三章 全文总结、创新点及后续研究展望

1 全文总结

2 创新点

3 不足

4 后续研究展望

附录

致谢