脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性和生物转化的研究

摘要

真菌毒素是由真菌或霉菌产生的有毒次级代谢产物，广泛污染各种饲料原料和成品饲料。动物食入被真菌毒素污染的饲料会造成动物的真菌毒素中毒。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是禾谷镰刀菌在生长的过程中产生的一种主要代谢产物，是单端孢霉烯族毒素中的一种，广泛污染各种谷物和饲料。 本论文主要研究在常规污染剂量下DON对小鼠的毒性和对其生物转化方发法。 试验Ⅰ脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠的生长性能、血液生化和组织病理学的影响。 昆明小鼠40只，分为4组，每组10只，雌雄各半，分别饲喂1mg kg<'1>DON+基础日粮(1mgDON组)、3mgkg<'-1> DON+基础日粮(3mgDON组)、5mg kg<'-1>DON+基础日粮饲料(5mgDON纽)和基础日粮(对照组)。饲喂20天后分别测定生长性能、血清生化、血常规和免疫器官的重量(胸腺，脾脏)等指标，并且观察肝脏、脾脏、十二指肠、胃、肾脏和胸腺的病理变化。结果表明5mg DON组在增重、饲料转化率、免疫器官的重量(胸腺，脾脏)、红细胞计数、平均红细胞体积和血小板计数等方面与对照组相比差异显著；而1mg DON组和3mg DON组与对照组相比差异均不显著。在生化方面，5mg DON组血清中的总蛋白、球蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯等方面与对照组相比较差异显著。5mg DON组的组织器官的病理变化主要表现为：肝脏的淤血、凋亡细胞增加、细胞间的界限不明显、部分细胞核消失和部分肝细胞肿胀；脾脏被膜增厚、脾小梁增生、部分脾细胞变性坏死、脾脏淤血；胸腺的局部出血；胃绒毛的萎缩和局部出血；十二指肠肠绒毛萎缩或脱落；心肌萎缩、心肌变性、心肌细胞肿胀和肾脏髓质出血、肾小球内有浸出物和部分上皮细胞变性等。 试验Ⅱ脱氧雪腐镰刀烯醇对CHO-K1和HL-7702细胞系的细胞毒性在培养基中加入不同浓度DON(DON终浓度分别为0ng mL<'-1>，100ng m<'-1>，200ng mL<'-1>，400ng mL<'-1>，800ng mL<'-1>)，分别用MTT法测定DON对中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)和人肝细胞(HL-7702)的毒性作用，用放射免疫法测定细胞上清液中的白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度。结果表明在低浓度时DON对细胞上清液中(100～200 ng mL<'-1>)IL-2、IL-6和TNF-α的浓度没有明显的抑制作用，但是在高浓度(400～800 ng mL<'-1>)时，却抑制了它们的表达。通过MTT法测得CHO-K1和HL-7702的半抑制浓度(IC<,50>)分别为123.5ng mL<'-1>和336.2 ng mL<'-1>。同时在高浓度(400～800 ng mL<'-1>)时能明显抑制CHO-K1和HL-7702的生长。试验Ⅲ脱氧雪腐镰刀茵烯醇生物转化茵的分离和鉴定以脱氧雪腐镰刀茵烯醇(DON)为唯一碳源，通过富集培养从土壤中分离到一株可以生物转化DON的真菌，编号为NJA-1。用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增了该菌的ITS区间，包括ITS1和ITS2，扩增片段大小为565bp，通过在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库上比较将该菌鉴定了属，然后用种间引物Bt2a和Bt2b扩增了该菌的β-tubulin基因序列，扩增片段大小为511pb。通过ITS和β-tubulin基因序列分析和形态学观察最终鉴定该菌株为塔宾曲霉。该菌的β-tubulin基因序列在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB的登录号为DQ902579，其与塔宾曲霉AY820009的相似性为99％。 试验Ⅳ NJA-1菌的体外生物转化和转化产物的检测把NJA-1加入含有不同浓度DON的无机盐培养基中，在30℃， 120r min<'-1>，振荡培养14d后，可以转化94.4％的DON。最高浓度达到40mg L<'-1>。分别用薄层层析(TLC)，高效液相色谱(HPLC)和高效液相色谱一质谱联用(HPLC-MS)对DON的生物转化产物进行了检测。结果表明在365nm紫外灯下检测可见其具有荧光。HPLC检测其既有紫外吸收(波长：218nm)和荧光吸收(Ex=340，Em=450)。HPLC-MS检测其转化产物的相对分子量为314.4，其分子量比DON大18.1，证明NJA-1可以水解DON。 试验Ⅴ生物转化茵NJA-1对饲料中DON的转化效果昆明小鼠40只，分为4组，每组10只，雌雄各半，分别饲喂基础日粮(对照组)5mg kg <'1>DON+5g kg <'1>NJA-1菌(菌+DON组)、5mg kg<'-1>DON+基础日粮(5mgDON组)、5g kg <'1>NJA-1菌+基础日粮饲料(菌组)和。饲喂20天后分别测定生长性能、血清生化、血常规和免疫器官的重量(胸腺，脾脏)等指标，并且观察肝脏、脾脏、十二指肠、胃、肾脏和胸腺的病理变化。试验结果表明在饲料添加5g kg<'-1>的NJA-1菌能减少DON引起的毒性作用。同时在饲料中添加5g kg<'-1>的NJA-1茵没有对昆明小鼠造成明显的副作用，该试验为NJA-1菌的进一步应用研究奠定了基础。

目录

论文说明：符号及缩略语的说明

声明

摘要

第一篇综述部分

第一章饲料中常见的真菌毒素及其毒性

1单端孢霉烯族毒素

2黄曲霉毒素

3赭曲霉毒素

4杂色曲霉毒素

5伏马菌素

参考文献

第二章饲料中真菌毒素污染情况和脱毒

1我国饲料中的真菌毒素污染情况

2饲料中真菌毒素的脱毒

3真菌毒素的预防

参考文献

第二篇试验部分

第三章脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠生长性能、血液生化和组织病理学的影响

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第四章脱氧雪腐镰刀烯醇对CHO-K1和HL-7702的细胞毒性

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第五章脱氧雪腐镰刀菌烯醇生物转化菌的分离和鉴定

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

第六章NJA-1菌的体外生物转化和转化产物的检测

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

第七章NJA-1菌对饲料中DON的转化效果

1材料和方法

2结果

3 讨论

参考文献

全文总结

全文创新点

附录

致谢

攻读博士学位期间发表和完成的学术论文