多胺氧化酶在脱落酸诱导玉米叶片细胞溶质抗氧化防护中的作用

摘要

植物激素脱落酸(abscisic acid，ABA)可以调节植物抗逆(包括干旱、冷害、盐害等)的多种生理反应和分子生物学效应。过去的研究结果已经表明ABA能够诱导过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)产生以及抗氧化基因的表达，但有关ABA诱导植物抗氧化防护能力提高的详细机制仍有许多问题尚不清楚。多胺氧化酶(polyamine oxidases，PAO)是一种主要分布在禾谷类等单子叶植物中的胺氧化酶。它分子中含有黄素蛋白(flavoprotein，FAD)，能将细胞产生的胺类物质(如亚精胺和精胺)氧化成醛，并释放NH3和H2O2。目前关于PAO的研究多集中于其在细胞壁硬化以及程序性细胞死亡中的作用，有关ABA诱导的H2O2产生中，PAO的贡献及功能研究还非常少，特别是PAO对亚细胞区室细胞溶质抗氧化防护系统的影响，目前尚未见报道。为此，本研究以玉米(Zea mays L.)叶片为材料，应用组织化学和细胞化学、酶活性分析以及半定量RT-PCR相结合的手段，进一步研究玉米多胺氧化酶(maize polyamine oxidases，MPAO)是否参与ABA诱导的玉米叶片中H2O2产生及其在细胞溶质抗氧化防护的作用。主要的研究结果如下： 采用半定量RT-PCR的方法，100μM ABA处理后，玉米叶片中MPAO基因转录水平与对照相比，在10 min至20 min时出现一个快速、瞬时的上调；另一方面，相对于对照组，质外体MPAO活性在ABA处理后迅速上升，在0.5 h达到最大后开始下降，即外源ABA处理能诱导其基因表达和酶活性的提高。 DAB在过氧化物酶催化下能与H2O2反应生成深棕色的多聚化合物。本研究用DAB染色检测H2O2量的变化来揭示MPAO在外源ABA诱导H2O2产生中的作用。从组织化学图片中可以看出，在外源ABA的处理下则迅速地引起了玉米叶片H2O2的大量积累。分别采取MPAO的两种抑制剂，并结合ABA处理来观察它们对外源ABA诱导玉米叶片H2O2积累的影响。结果表明不同浓度的两种抑制剂(0.1，0.5和1 mM)均对ABA诱导的玉米叶片H2O2的积累有一定抑制作用。 用细胞化学方法来进一步揭示MPAO在外源ABA诱导H2O2积累中的作用。电镜照片表明，在外源ABA处理条件下，玉米叶肉细胞位于朝向细胞间隙的细胞壁上有大量的黑色沉积物，表明外源ABA诱导质外体产生大量的H2O2。抑制剂实验中，guazatine和DADD处理后叶肉细胞壁上的沉积物明显减少，这与组织化学的结论是一致的。而抑制剂预处理8n后结合纯水处理，未发现在玉米叶肉细胞质外体有H2O2的产生，表明抑制剂本身对于实验结果没有影响。MPAO酶活性结合半定量RT-PCR分析以及组织化学结合细胞化学方法的研究进一步提示，MPAO可能参与了ABA诱导的玉米叶片H2O2的产生，MPAO是玉米叶片中活性氧的来源之一。 研究表明，ABA上调了玉米叶片细胞溶质抗氧化防护酶SOD，APX的活性。为了明确MPAO与玉米叶片细胞溶质抗氧化防护的关系，本研究用MPAO抑制剂guazatine和DADD预处理8h，再用100μM ABA处理8h或12 h来进行研究。结果表明这两种抑制剂均部分抑制ABA诱导的抗氧化防护酶cAPX和SOD4基因的表达以及细胞溶质APX和SOD活性的提高，并且抑制剂浓度越高抑制程度越明显。这提示MPAO可能参与了ABA诱导玉米叶片细胞溶质抗氧化防护系统的调节。 为了进一步明确MPAO对玉米叶片细胞溶质抗氧化防护系统的影响，用MPAO的最适底物(Spd，Spm)处理玉米离体植株。1 mM Spd处理引起了细胞溶质抗氧化防护能力的提高。外源多胺处理提高了离体玉米植株抗氧化防护基因cAPX和SOD4的表达，也提高了细胞溶质抗氧化防护酶APX，SOD的活性。另一方面，MPAO抑制剂(guazatine、DADD)和H2O2清除剂(CAT、DMTU)的实验结果表明抑制剂或清除剂均明显抑制了多胺诱导的抗氧化防护酶cAPX和SOD4基因表达以及细胞溶质APX和SOD活性的提高，并且抑制剂浓度越高抑制程度越明显。这说明MPAO是通过分解多胺产生的代谢产物H2O2诱导玉米叶片细胞溶质抗氧化防护，H2O2是一个重要的中间信使。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

第一章文献综述

1 ABA诱导活性氧的产生途径及活性氧的生理作用

2植物中胺氧化酶的研究进展

3 ABA诱导的抗氧化防护系统

4本研究的目的及研究内容

第二章MPAO参与了ABA诱导的玉米叶片H2O2的产生

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三章MPAO参与了ABA诱导的玉米叶片细胞溶质抗氧化防护

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第四章外源多胺处理提高了玉米叶片细胞溶质的抗氧化防护

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

全文讨论

全文结论

创新之处

存在的问题

参考文献

致谢

攻读学位论文期间发表与投送的论文