一氧化氮在水分胁迫和脱落酸诱导玉米叶片抗氧化防护中的作用

摘要

植物激素脱落酸(abscisic acid,ASA)可以调节植物抗逆(包括干旱、冷害、盐害等)的多种生理反应和分子生物学效应。一氧化氮(nitric oxide,NO)是一种多功能生物活性分子,作为信号参与基因活化、蛋白质表达和酶活性的调节使植物对逆境胁迫做出应答。最近的研究表明ABA和水分胁迫都可以引起NO和过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)的产生,以及细胞质Ca2+([Ca2+]i)和钙调素(calmodulin,CaM)增加,诱导抗氧化基因的表达,提高植物抗氧化防护能力。NO在ABA诱导的抗氧化防护中起重要作用。然而,有关NO作为信号分子介导ABA诱导的抗氧化防护信号转导机制仍有待阐明。本研究以玉米叶片为材料,研究了在ABA和水分胁迫诱导的抗氧化防护中NO的作用以及H2O2,Ca2+/CaM与NO之间的关系。主要的研究结果如下： 用NO特异的荧光染料4'5'-二氨基荧光素二乙酸酯(4,5-diaminofluorescein diacetate,DAF-2DA)对小决叶片进行染色,并用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察荧光变化。10 mM CaCl2处理迅速诱导NO产生和NOS活性增加。CaCl2处理1 h时NO达到最大值并一直持续到2 h,2 h后开始减弱。在CaCl2处理1 h时,细胞溶质和微粒体部分一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)活性达到最大值,分别比对照增加了92.7％和148％。NO清除剂c-PTIO(2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide),NOS抑制剂L-NAME(NG-nitro-L-Arg methylester)、PBITU(S,S'-1,3-phenylene-bis(1,2-ethanediyl)-his-isothiourea)和CaM拮抗剂预处理都抑制了CaCl2诱导的NO产生和细胞溶质及微粒体部分NOS活性增加。另一方面,Ca2+抑制剂和CaM拮抗剂预处理几乎完全抑制了ABA和H2O2诱导的NO产生和细胞溶质及微粒体部分NOS活性的增加,表明玉米叶片中ABA和H2O2是通过Ca2+_CaM依赖型的NOS途径诱导NO产生的.研究还发现外源NO处理显著提高了玉米叶片叶肉细胞[Ca2+]i、玉米叶片CaM1基因表达和CaM含量。NO清除剂c-PTIO和NOS抑制剂L-NAME预处理部分抑制了ABA处理后期[Ca2+]i和CaM含量的提高,表明NO参与ABA诱导的Ca2+/CaM水平增加。此外,Ca2+鳌合剂、Ca2+通道阻塞剂和CaM拮抗剂预处理还显著抑制了NO诱导的抗氧化防护基因SOD4、cAPX,GRl表达和叶绿体及细胞溶质抗氧化酶SOD、APX、GR活性的增加,说明玉米叶片中NO诱导的Ca2+/CaM增加参与了NO诱导的亚细胞抗氧化防护系统。这些结果暗示了Ca2+/CaM作为NO的上游和下游信号分子参与ABA和H2O2诱导玉米叶片抗氧化防护。水分胁迫处理能够诱导玉米叶片叶肉细胞NO的产生。水分胁迫处理1 h时NO开始产生,一直持续到4h达到最大,4 h后减弱。水分胁迫诱导了NOS活性增加,水分胁迫处理4 h时细胞溶质部分NOS活性是对照的4.3倍,微粒体部分的NOS活性是对照的7.2倍。这些结果表明微粒体部分NOS活性比细胞溶质部分高且更容易受到水分胁迫的影响。NOS抑制剂L-NAME和PBITU预处理显著抑制了水分胁迫诱导的细胞溶质和微粒体部分NOS活性的增加,而NO清除剂c-PTIO和硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)抑制剂KCN、NaN3抑制了水分胁迫诱导的NO产生,但并不影响NOS活性。结果表明NOS是水分胁迫诱导NO产生的主要来源,NR也部分参与了水分胁迫诱导的玉米叶片NO的产生。 分别用DAB(3,3-diaminobenzidine)染色的组织化学、分光光度计法和CeCl3染色的细胞化学方法检测了NO对水分胁迫诱导的H2O2累积的影响。结果显示SNP提高了水分胁迫诱导的叶绿体和细胞溶质谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(astorbate peroxidase,APX)的活性,减少了水分胁迫诱导的H2O2的积累,而[Fe(III)CN]在一定程度上降低了亚细胞抗氧化防护酶的活性,不影响H2O2的积累。施用NO清除剂、NOS抑制剂和NR抑制剂的研究结果表明NO参与外源H2O2和水分胁迫诱导的SOD4、cAPR,GRl的表达和叶绿体及细胞溶质抗氧化防护酶SOD、APX、GR活性的提高。这些结果表明NO能够清除水分胁迫诱导产生的H2O2至少部分归因于NO诱导的不同亚细胞分隔抗氧化防护的协同作用。 对水分胁迫下ABA积累、Ca2+/CaM增加和NO产生之间的关系的研究结果显示,水分胁迫积累的内源ABA是水分胁迫诱导NO产生和激活NOS活性的关键诱导因子；NO参与了水分胁迫诱导的ABA积累、[Ca2+]i提高、CaM1基因表达和CaM含量的增加。另一方面,Ca2+抑制剂和CaM拮抗剂预处理几乎完全抑制了水分胁迫诱导的NO的产生和细胞溶质及微粒体部分NOS活性的增加,表明Ca2+/CaM介导了水分胁迫诱导的玉米叶片NO的产生。此外,研究还发现水分胁迫诱导叶绿体和线粒体NO产生,Ca2+鳌合剂和CaM拮抗剂预处理只抑制了水分胁迫诱导的线粒体NO产生而对叶绿体NO的产生没有影响,表明在玉米叶片叶绿体和线粒体中合成NO的NOS种类可能有所不同。 上述研究表明,ABA和水分胁迫诱导的[Ca2+]i和CaM含量的增加激活了NOS活性合成NO,NO又反过来影响Ca2+/CaM水平,进而提高不同亚细胞分隔抗氧化酶活性及相关基因的表达。NO和Ca2+/CaM之间的交叉谈话在外源ABA或水分胁迫积累的ABA信号转导过程中起重要作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语词汇表

声明

第一章文献综述

1 水分胁迫和脱落酸(Abscisic acid,ABA)诱导的抗氧化防护系统

2植物中一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的研究进展

3 NO信号传导

4结论与展望

第二章Ca2+/CaM作为NO的上游和下游信号分子参与ABA诱导的玉米叶片抗氧化防护

1材料与方法

2结果与分析

2.1 CaM参与了外源Ca2+诱导的NO的产生和NOS活性提高

2.2 Ca2+/CAM参与了ABA和H202诱导的NO产生和NOS活性增加

2.3 NO提高了[Ca2+]i和CaM

2.4 Ca2+/CAM参与了NO诱导的亚细胞抗氧化防护

3讨论

第三章NO降低水分胁迫诱导的H2O2累积涉及到了亚细胞抗氧化防护

1材料与方法

2结果与分析

2.1水分胁迫诱导玉米叶片NO产生

2.2 NO减少了水分胁迫诱导的H2O2累积

2.3 NO提高了水分胁迫诱导的亚细胞抗氧化防护酶的活性

2.4 NO参与了水分胁迫和H2O2诱导的亚细胞抗氧化防护

3讨论

第四章水分胁迫下ABA诱导的抗氧化防护过程中Ca2+/CaM与NO之间的关系

1材料与方法

2结果与分析

2.1 ABA是水分胁迫诱导NO产生的关键因子

2.2 NO参与了ABA诱导的亚细胞抗氧化防护

2.3 Ca2+/CAM介导了水分胁迫诱导的NO产生

2.4 NO提高了水分胁迫诱导的[Ca2+]i

2.5 NO提高了水分胁迫诱导的CaM1基因表达和CaM含量

2.6 Ca2+/CaM与水分胁迫诱导的玉米叶绿体、线粒体NO产生的关系

2.7 NO可能参与了水分胁迫诱导的ABA积累

3讨论

第五章全文结论

1 研究小结

2 创新之处

3 存在问题

参考文献

致谢

攻读学位期间发表与投送的论文