酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽制备及分离纯化研究

摘要

人体内血管紧张素转换酶(ACE)活性过高是引起高血压的关键因素。ACE抑制肽能竞争性地与ACE活性中心结合，而抑制ACE的活性，起到降血压的作用。现有研究表明，这些多肽分子量大都在200-2000之间，且以2-10个氨基酸残基组成的肽较为多见。近年来，国内外利用食物蛋白获取ACE抑制肽的研究广泛开展，日本已有产品上市。目前，我国在这方面的研究逐渐兴起，但还未进行工业化生产。 本研究以酪蛋白为原料，通过筛选出最佳蛋白酶，并对酶解条件进行优化，制备出了具有较高抑制活性的ACE抑制肽；同时，通过超滤和凝胶层析对酶解产生的ACE抑制肽进行分离纯化，并研究了具有最高ACE抑制活性的凝胶层析组分的多肽分子量分布和结构初步推测。主要研究结果如下： 1、根据Cushman等的方法，对血管紧张素转换酶抑制肽活性体外检测方法进行了优化，调整了反应体系中ACE用量，抵消了HHL、酶解物等对检测结果的影响，验证了方法的可靠性、重复性和精确性，确立了简便可行的ACE抑制肽体外海性检测方法。 2、采用胃蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、Alcalase五种蛋白酶，分别在各自最适条件下水解酪蛋白，通过比较水解过程和酶解产物的ACE抑制活性，筛选出最佳蛋白酶Alcalase用于ACEIP制备。酪蛋白经该酶水解5小时后，产物的ACE抑制活性达到最大，ACE抑制率为56.1±0.7％。 3、选取Alcalase水解酪蛋白制备血管紧张素转换酶抑制剂(ACEIP)。试验中选择温度、酶与底物浓度比、底物浓度、pH值等影响酶解因素的不同水平，以酶解产物的ACE抑制率为指标，采用响应曲面法对酶解条件进行了优化，并建立了酶解产物ACE抑制率的多元二次回归模型方程。实验表明，在温度为60℃、酪蛋白浓度为7.11％、AlcalaSe和酪蛋白浓度比为7.83％、pH为7.0时，水解4小时所得酶解液ACE抑制率为70.5％，比蛋白酶筛选时所得抑制率提高了25.7％。酶解产物的IC50为0.54mg/mL。 4、在最佳条件下水解酪蛋白制备ACEIP。选用分子截留量为3kDa的膜对酶解液进行超滤，然后经SephadexG-15凝胶层析分离，并对其中一组分通过RP-HPLC和ESI-MS进行了分析。实验结果表明，超滤使ACE抑制活性提高了8.8％，IC50下降了0.15mg/mL。超滤物经凝胶层析后得到7个具有ACE抑制活性的组分，其中组分4的IC50为0.057mg/mL。采用RP-HPLC分析发现，组分4成分已较为简单，但还不是纯的多肽。经ESI-MS质谱分析，测定其中主要是分子量在182-752Da之间的多肽。

目录

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声明

第一章文献综述

1.1 ACE及其调节血压机理

1.2 ACE抑制肽的作用机理

1.3 ACEIP活性的评价方法

1.4 ACEIP的主要食物蛋白源

1.4.1乳类蛋白

1.4.2肉类蛋白

1.4.3植物蛋白

1.4.4其他食物或食品来源蛋白

1.5 ACEIP的制备方法及分离纯化

1.5.1 ACEIP的制备

1.5.2分离纯化方法

1.6 ACEIP结构与功能的关系研究

1.7研究前景

1.8本研究的目的及内容

参考文献

第二章ACEIP抑制活性体外检测方法优化的研究

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要设备

1.3实验方法

2结果与讨论

2.1方法的可靠性研究

2.2方法精确性的研究

2.3方法重复性的研究

3本章小结

参考文献

第三章酶解酪蛋白制备ACEIP蛋白酶的筛选

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要设备

1.3实验方法

2结果与讨论

2.1蛋白酶活力的测定

2.2酪蛋白水解度及水解产物ACE抑制活性的测定

2.3水解酪蛋白最佳用酶的确定

3本章小结

参考文献

第四章Alcalase水解酪蛋白制备ACEIP条件的优化

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要设备

1.3实验方法

2结果与讨论

2.1多元模型方程的建立与显著性检验

2.2酪蛋白酶解液ACE抑制率响应曲面分析与优化

2.3模型验证实验

2.4水解时间的确定

2.5酪蛋白酶解产物的IC50测定

3本章小结

参考文献

第五章酪蛋白源ACEIP的分离纯化和初步分析

1材料与方法

1.1实验材料

1.2主要仪器

1.3实验方法

2结果与讨论

2.1超滤分离酪蛋白Alcalase酶解液

2.2超滤液中肽类物质分析

2.3 SephadexG-15分离纯化ACEIP

2.4 RP-HPLC对组分4的分析

2.5 ESI-MS分析组分4

3本章小结

参考文献

全文结论

全文创新点

致 谢