猪链球菌流行病学调查和PCR-RFLP基因分型研究

摘要

猪链球菌是一种条件性致病菌，通常定居在感染猪的上颚扁桃体，当感染猪的抵抗力降低时，可能引发猪链球菌病的流行，因此从猪扁桃体内分离猪链球菌对该病的流行病学监测具有重要的意义。研究发现相同血清型的不同菌株及不同血清型菌株间的毒力存在差异，而且相同血清型的菌株并不完全导致相同的疾病，但传统的血清分型方法不能很好反映菌株的特征。本试验尝试建立一新的基因分型方法PCR-RFLP对猪链球菌进行研究。
　　 1.表现健康猪的猪链球菌流行病学调查：对采自杭州、重庆等20个不同地区屠宰场的248份扁桃体或淋巴结样品进行细菌分离培养，然后用GDH、CPS1i、CPS2j、CPS7h、CPS9g基因序列的PCR方法进行种型鉴定并用血清凝集试验复检，随后检测其毒力因子检测，应用多位点序列分型（Multilocussequencetyping，MLST）系统研究菌株间的遗传关系。结果：从248份样品中共检出14株猪链球菌（检出率为5.65％），其中3株为猪链球菌2型，2株为猪链球菌7型，1株为猪链球菌9型，8株不能定血清型；6株定型菌株血清凝集试验结果与PCR鉴定结果一致；对6株定型菌进行6个毒力因子（mrp、epf、sly、orf2、fops、gapdh）检测发现5种毒力基因型：A1Cps2+mrp-epf+sly+orf2+tbps+gapdh+、A2Cps2+mrp-epf+sly-orf2_fbps+gapdh-、A3Cps7+mrp+epf-sly-orf2-tbps-gapdh+、A4Cps9+mrp-epf-sly-orf2-fbps+gapdh+、A5Cps7+mrp-epf-sly-orf2+tbps+gapdh+，A1和A2型的菌株为弱毒株；经MLST分析3株猪链球菌2型属于ST1，1株7型属于ST29，1株9型（CQ15）属于一个新ST型，该型被猪链球菌MLST数据库（http：//ssuis.mlst.net）收录并编号为ST128。
　　 2.PCR-RFLP的建立及其在猪链球菌基因分型中的应用：本试验对32个血清型（1～31，1/2）猪链球菌参考株和47株背景明确的猪链球菌分离株的16S-23SISR序列进行扩增，首先建立并优化PCR最佳反应体系、反应条件和酶切最佳反应体系、反应条件，扩增产物经酶切、凝胶电泳，最后在紫外灯下观察电泳图谱。结果：1上述菌株的PCR产物经双酶切后共得到22种RFLP型：其中Aa型有25株，占总菌株数的31.6％；Ⅰb型有20株，占总菌株数的25.3％；Bf型有7株，占总菌株数8.9％；Ga型有4株，占总菌株数的5.1％；Be和Ka型各有3株，占总菌株数3.8％；Bh型有2株，占总菌株数2.5％；Eb、Bb、Gg、Di、Hc、Fj、Ca、Bd、Jk、Ll、Ie、Bm、Ag、Mn、Io型各有一株.2对酶切基因型进行统计分析，获得的PCR-RFLP方法的分辨指数为0.83。3猪链球菌1/2型和2型经PCR-RFLP分析，产生不同的RFLP型，可以区分这两种血清型，而其他的血清型无法用该法区分。4分离株中共有18株强毒株，其中7型一株，9型一株，2型16株，这些菌株经PCR-RFLP分析发现7型和2型的强弱毒株分别具有相同的RFLP型，所以无法用该法进行猪链球菌强弱毒株的区分。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一篇 文献综述

第一章 猪链球菌基因分型方法研究进展

1 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR)

2 脉冲凝胶电泳（Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)

3 多位点酶电泳技术（Multi-Locus enzyme electrophoresis,MLEE)

4 多位点序列分型技术（Multilocus sequence typing,MLST)

5 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP)

6 随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)

7 核糖体分型技术（Ribotyping)

8 限制性内切酶分析

9 应用16SrRNA 对猪链球菌进行研究

10 分子伴侣（Cpn60 ）基因对猪链球菌的基因分群

11 利用16S-26S rDNA ISR 对猪链球菌进行研究

12 基因指纹图谱分析（Genomic Fingerprinting）

13 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment polymorphism,RFLP）

14 PCR-RFLP

15 重复系列PCR(repetitive repetitive clcment PCR,Rep-PCR)

16 毒力相关基因分布分型（Virulence-nssociated gene profiling by PCR ）

17 已有分型技术的联合应用

参考文献

第二篇 试验研究

第一章 表观健康猪群猪链球菌携带情况流行病学调查

摘要

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 PCR-RFLP的建立及其在猪链球菌基因分型中的应用

摘要

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

全文总结

致 谢