松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2克隆和序列分析及RNAi研究

摘要

松材线虫是松树萎蔫病（Pine wilt disease）的病原，通过介体天牛传播病害，自1982年在江苏南京首次发现后，目前松材线虫已经蔓延至我国14个省（自治区、直辖市）的192个县级行政区，使我国松林资源与生态平衡遭到严重破坏，经济损失巨大。目前对松材线虫的研究主要集中在松材线虫的生物学、分类鉴定、松材线虫病发生条件和防治方法等方面，而关于松材线虫致病性的分子机理知之甚少。
　　 乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是生物神经传导中的一种关键性酶，除了神经学功能外，还可能涉及细胞凋亡和寄生线虫细胞发育、行为调控及侵染致病等多个生理进程。松材线虫AChE基因克隆的相关研究尚未见报道，本论文通过反转录PCR（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得了松材线虫AChE基因Bx-ace-2的cDNA全长，研究了该基因的内含子及外显子的排列结构；通过Southern杂交技术检测了该基因在基因组中的拷贝数；通过氨基酸序列比对分析，构建了乙酰胆碱酯酶基因的进化树；利用RNAi技术对克隆的Bx-ace-2进行了松材线虫体外干涉的初步研究。研究结果为今后进一步开展对松材线虫乙酰胆碱酯酶基因功能分析，从而推进对松材线虫致病分子机制的理解打下基础。
　　 1松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2克隆和分析
　　 克隆的Bx-ace-2 cDNA全长为2010 bp，有1878 bp的开放阅读框（ORF），推测其编码的蛋白有625个氨基酸；Bx-ace-2基因组克隆长为2192bp，含有7个内含子，Southern杂交实验表明该基因在松材线虫基因组中以单拷贝存在。氨基酸序列比对和同源性分析显示，Bx-ace-2编码的乙酰胆碱酯酶与已报道的秀丽小杆线虫ACE-1、ACE-3和ACE-4型乙酰胆碱酯酶的相似性在28％-31％之间，而与秀丽小杆线虫ACE-2及甘薯茎线虫、南方根结线虫、大豆胞囊线虫、马铃薯白线虫和胎生网尾线虫的ACE-2型乙酰胆碱酯酶的氨基酸序列相似性在44％-52％之间；构建的系统进化树也显示了松材线虫乙酰胆碱酯酶与其它线虫的ACE-2型乙酰胆碱酯酶具有相对更近的遗传距离，因此推测该松材线虫乙酰胆碱酯酶也属于ACE-2型。
　　 2松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2的RNAi研究
　　 研究了松材线虫吞咽FITC过程，浸泡10 h后松材线虫吞咽明显，24 h后线虫全身荧光信号最强。以Bx-ace-2 cDNA为模板，体外转录合成dsRNA，对经过不同dsRNA浸泡液处理24小时后的松材线虫进行RT-PCR检测显示，ace dsRNA浸泡处理后的松材线虫Bx-ace-2的转录水平明显降低，而经gfp dsRNA浸泡处理后的松材线虫没有检测到Bx-ace-2的转录水平变化。对处理后线虫的表型观察显示，ace dsRNA浸泡处理对松材线虫的活力没有明显影响，同时未发现线虫的贲门收缩的差异；浸泡液中加入脂质体对RNA干涉作用的影响不明显；松材线虫的灰葡萄孢接种实验显示经ace处理的松材线虫繁殖力明显低于对照。

目录

文摘

英文文摘

缩略语

上篇 文献综述

第一章 松树萎蔫病概述

1 松材线虫的分类学地位

2 松材线虫形态学特征

3 松材线虫的分布与为害

4 松材线虫寄主范围及传播方式

5 松材线虫病的致病机理

6 松材线虫的致病基因的克隆

第二章 乙酰胆碱酯酶研究进展

1 乙酰胆碱酯酶概述

2 乙酰胆碱酯酶的分子类型

3 乙酰胆碱酯酶的结构

4 AChE的功能

5 线虫乙酰胆碱酯酶研究进展

第三章 植物寄生线虫RNAi的研究进展

1 RNAi作用机制

2 线虫RNAi机制的特点

3 植物寄生线虫RNAi研究

下篇 研究内容

第一章 松材线虫乙酰胆碱酯酶基因Bx-ace-2的克隆与分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 松材线虫乙酰胆碱酯酶基因体外RNAi研究

1 材料方法

2 结果

3 讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢