繁缕抗病毒活性蛋白的初步研究

摘要

繁缕(Stellaria media(L.) Villars)为石竹科(Caryophyllaceae)繁缕属(Stellar iaL.)植物，是一种药食同源植物。繁缕全草入药，有多种药用功效，尤其繁缕鲜汁液在治疗疱疹等病毒性皮肤病方面有显著疗效。为阐明其药效物质，本研究以抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)的活性为导向，从繁缕中分离纯化得到一种新的抗HSV-2活性蛋白，初步对其进行了理化性质、质谱和生物活性研究，发现其具有过氧化物酶(POD)和核糖体失活蛋白(RIP)的相关活性；本文同时对繁缕RIP基因的克隆和表达展开研究，首次克隆到Q1、Q2两个繁缕RIP基因并获得异源表达，为繁缕抗病毒药效物质的分离纯化和阐明提供了关键信息。主要研究结果如下：
　　 1繁缕活性蛋白分离纯化、结构及生物活性研究
　　 1.1繁缕活性蛋白分离纯化
　　 以抗病毒(HSV-2)活性为导向分离指标，采用50％-85％饱和度硫酸铵盐析、弱阳离子交换柱层析、葡聚糖凝胶柱层析及强阳离子交换柱层析技术，从繁缕中分离得到一种抗病毒活性蛋白。SDS-PAGE、FPLC、MALDI-TOFMS显示该蛋白达到色谱纯以上，精确分子量为35.157kD;PAS染色结果表明该蛋白是糖蛋白；IEF-PAGE电泳结果表明为碱性蛋白，等电点9.3＜pI＜9.6.
　　 1.2繁缕活性蛋白鉴定
　　 对分离得到的活性蛋白，应用MALDI-TOF MS进行肽指纹图谱分析，数据库检索未能发现与之匹配的数据。应用ESI-Q-TOF2 MS解析了活性蛋白的4个胰酶水解肽段的氨基酸序列，分别为GFEVIDAAK(Fr1)、GPSFAVQLR(Fr2)、AFSTNKGLAPGLLR(Fr3)和MGNTGVLTGERNDR(Fr4).数据库检索和比对结果显示获得的序列为蛋白新序列.多重序列比对结果表明其中Fr1和Fr4肽段与植物POD的部分氨基酸保守序列同源性较高。鉴定该蛋白是一种新的天然植物蛋白，命名为SAP(Stellaria Antiviral Protein)。
　　 1.3繁缕活性蛋白生物活性研究
　　 实验表明SAP具有抗病毒、抗肿瘤活性。体外抗病毒实验显示SAP可体外抑制HSV-2对细胞的感染，IC50达到0.37μM,CC50大于40μM。其在HSV-2感染初期作用效果最显著，作用机制与直接使病毒失活有关。体外抗肿瘤实验显示SAP有较强的抗人早幼粒白血病细胞HL-60和人结肠癌细胞LoVo生长活性，IC50分别为9.09μM和12.32μM，同时对正常细胞生长无明显作用，CC50大于40μM,具有显著地选择性抑制肿瘤细胞增殖作用.
　　 SAP具有较强的RNAN-糖苷酶活性和DNA超螺旋裂解活性。SAP对核糖体RNA和超螺旋DNA的这种切割作用具有不可修复性，可以称之为DNA（RNA）糖苷酶/脱嘌呤裂解酶，这种酶活性也许是SAP抗病毒、抗肿瘤的主要作用机制之一.体外POD活性实验表明SAP还具有较强的POD活性，酶活力大小为36.6Umin－1μg－1，Km值为0.01mol/L.
　　 2繁缕核糖体失活蛋白（RIP）基因的克隆及其原核表达研究
　　 2.1繁缕RIP基因克隆及序列分析
　　 采用同源克隆的方法，获得繁缕RIP基因保守区片段，结合RACE技术获得5’和3’非翻译区序列，将相关序列拼接，获得了2条繁缕RIP基因Q1(FJ860049)和Q2(FJ860050)的cDNA全长。Q1与Q2的开放阅读框（ORF）分别为858bp,765bp，其同源性为95.5％.Q1、Q2有390个碱基与同科其他植物RIP基因完全相同，且碱基的分布具有一定的规律性，但与不同科属植物RIP同源性较低.Q1、Q2和以DNA为模板获得的繁缕RIP基因Q(FJ860051)进行分析比较，证实繁缕RIP基因无内含子。
　　 Q1和Q2编码的繁缕RIP分别命名为Stellarin1和Stellarin2.二者的理论分子量分别为31.0kD和27.6kD,pI分别为9.40和9.54，都包含由23个氨基酸组成的信号肽。其理化特征均与Ⅰ型RIP和SAP相似，但与后者的同源性较低。序列分析发现，Stellarin1和Stellarin2与已知RIP产生抗病毒活性的特征区域同源性很高，相应保守区域完全相同，表明繁缕RIP具备抗病毒能力，预示繁缕存在多种抗病毒活性蛋白.
　　 2.2繁缕RIP基因原核表达
　　 将Q1、Q2连接到载体，获得重组质粒pET29a-Q1和pET29a-Q2，将其转化到大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS中.含有pET29a-Q1和pET29a-Q2的3种菌株分别在LB和TB培养基中振荡培养，并诱导表达.结果显示，在所有的处理中，Q1均未能获得可观察到的表达；Q2只在采用LB培养基的BL21(DE3)和BL21(DE3)plysS中得到低含量表达。Q1、Q2表达的产物对宿主细胞有毒性，抑制大肠杆菌的生长，从而导致Q1、Q2未能得到高效表达.

目录

文摘

英文文摘

缩略语

前言

第一章 文献综述

第一节 繁缕研究概况

1.繁缕本草考证

2.繁缕分类学研究

3.繁缕植物化学研究

4.繁缕分子系统学研究

5.繁缕杂草学研究

6.繁缕药用植物资源学研究

第二节 过氧化物酶研究进展

1.POD分子结构及组成

2.POD反应机理

3.POD分离纯化研究

4.POD的生理功能及其相关的分子生物学研究

第三节 核糖体失活蛋白研究进展

1.RIP类型和分布

2.RIP分子结构及组成

3.RIP酶学特性

4.RIP生理功能

5.RIP在异源生物中的表达

6.RIP在医学中的应用

本文研究目的和意义

参考文献

第二章 繁缕活性蛋白分离纯化

1.材料和方法

1.1 材料

1.2 试剂与耗材

1.3 实验仪器

1.4 实验方法

2.结果与分析

2.1 繁缕总氨基酸成分测定

2.2 蛋白粗提液制备

2.3 活性蛋白分离纯化结果分析

2.4 繁缕抗病毒蛋白导向分离

2.5 活性蛋白纯度检测

2.6 活性蛋白理化性质

3.讨论

参考文献

第三章 繁缕活性蛋白质谱分析

1.材料和方法

1.1 样品制备

1.2 N-端氨基酸序列分析

1.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析

1.4 四级杆飞行时间质谱(ESI-QUAD-TOF2)分析

1.5 蛋白质序列数据库检索

2.结果与分析

2.1 N-端氨基酸序列分析

2.2 MALDI-TOFMS分析

2.3 ESI-QUAD-TOF2MS分析

3.讨论

参考文献

第四章 繁缕活性蛋白生物活性研究

1.材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.2 抗HSV活性测定

1.3 抑制肿瘤细胞活性测定

1.4 RNAN-糖苷酶活性测定

1.5 对超螺旋DNA的切割作用

1.6 过氧化物酶活力测定

2.结果与分析

2.1 SAP抑制HSV-2活性研究

2.2 SAP抑制肿瘤细胞活性测定

2.3 繁缕蛋白组分及SAP的RNAN-糖苷酶活性

2.4 对超螺旋DNA的切割作用

2.5 SAP过氧化物酶活性测定

3.讨论

3.1 SAP抗病毒活性

3.2 SAP抗肿瘤活性

3.3 SAP RNAN-糖苷酶活性

3.4 SAP DNA超螺旋裂解活性及抗病毒、抗肿瘤机理初探

3.5 SAP过氧化物酶活性

参考文献

第五章 繁缕RIP基因克隆及序列分析

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2.结果与分析

2.1 繁缕总RNA提取

2.2 繁缕总DNA提取

2.3 繁缕RIP基因片段的扩增

2.4 RACE扩增

2.5 繁缕RIP基因全长的获得

2.6 繁缕Q1、Q2基因序列比较与分析

2.7 繁缕Ql、Q2编码氨基酸序列比较与分析

3.讨论

3.1 同源克隆的方法用于繁缕RIP基因的克隆

3.2 繁缕Stellarin 1和Stellarin2的特征分析

3.3 繁缕抗病毒药效物质基础

参考文献

第六章 繁缕RIP基因原核表达

1.材料与方法

1.1 供试材料、菌株及质粒

1.2 转化大肠杆菌、扩大培养

1.3 质粒提取及Bam HI、Hind Ⅲ双酶切片段回收、连接、转化

1.4 诱导外源基因表达

1.5 SDS-PAGE电泳检测表达的蛋白

2 结果与分析

2.1 转化大肠杆菌、扩大培养

2.2 质粒提取及BamHI、Hind Ⅲ双酶切片段回收、连接、转化

2.3 pET 29a-Q1、pET 29a-Q2的鉴定

2.4 pET 29a-Q1、pET 29a-Q2中Q1、Q2基因的序列分析

2.5 诱导外源基因表达

3.讨论

3.1 菌株和载体对Q1、Q2表达的影响

3.2 培养基对Q1、Q2表达的影响

3.3 Q1、Q2的诱导表达产物对菌株生长的影响

3.4 Q1、Q2基因序列本身可能对表达的影响

参考文献

全文讨论与总结

1.全文结论

2.本文的创新点

3.本文存在的不足和下一步工作

附录 繁缕RIP基因序列：

致谢

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