RNAi抑制Smad4基因表达对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响

摘要

Smads蛋白家族是近年新发现的细胞内信号传导蛋白，在转化生长因子（transforming growth factor， TGF-β）超家族成员的信号转导通路中具有重要的作用。Smad4作为Smad蛋白家族重要成员之一，是哺乳类中发现的唯一一种Co-Smad，被认为是TGF-β各成员信号传递必需的中心转导分子。Smad4在TGF-β/Smad信号通路中发挥着关键作用，其表达缺失或者突变都会引起TGF-β/Smad信号转导紊乱，从而对机体组织或细胞产生重要影响。近年来研究发现小鼠卵巢中存在Smad4信号转导途径，TGF-β对卵泡的分化调节很有可能是通过Smad4信号途径实现。
　　 本文利用RNAi技术沉默Smad4基因，探讨其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响。设计并合成靶向Smad4的小分子干扰RNA，在脂质体的介导下转染猪卵巢颗粒细胞，荧光定量PCR检测Smad4 mRNA表达情况；MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法分析检测细胞活性；原位末端核苷酸标记法（TUNEL）及Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况；荧光定量PCR检测Bcl-2，Bax的mRNA表达水平。
　　 1 Smad4-siRNA转染猪卵巢颗粒细胞及其效率检测
　　 根据猪Smad4基因序列设计小分子RNA，利用脂质体转染猪卵巢颗粒细胞。荧光定量PCR检测Smad4 mRNA表达水平，Smad4-siRNA转染浓度为8pmoL，作用36h时，Smad4-siRNA抑制效果最好，siRNA实验组较空白对照组下降84％(p＜0.01).利用MTT比色法检测干扰后颗粒细胞活性，结果显示，siRNA实验组细胞活性(0.27)显著低于对照组(0.31)（p＜0.05），说明Smad4-siRNA转染对卵巢颗粒细胞的增殖有明显的抑制作用，推测RNAi抑制Smad4基因表达可能引起猪卵巢颗粒细胞凋亡。
　　 2 RNAi抑制Smad4表达对颗粒细胞凋亡的影响
　　 采用原位末端核苷酸标记法(TUNEL)和Annexin V/PI流式细胞仪进行细胞凋亡情况分析。结果显示，siRNA实验组较对照组凋亡细胞明显增多，Smad4基因表达被抑制后，细胞凋亡率(22.1％)显著高于对照组(17.0％)(p＜0.05)。表明沉默Smad4基因可促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。
　　 3 RNAi抑制Smad4表达对Bcl-2和Bax的影响
　　 采用荧光定量PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2以及Bax在颗粒细胞中相对表达水平。结果显示，与空白组相比，siRNA实验组Bcl-2表达显著下调，降低79％(p＜0.01).结果进一步表明沉默Smad4基因可促进猪卵巢颗粒细胞凋亡，其机制可能与调控Bcl-2表达有关。

目录

文摘

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项目基金资助

缩略语

文献综述

第一章 卵巢颗粒细胞凋亡相关研究进展

1 细胞凋亡的发现及定义

2 卵巢颗粒细胞凋亡及其特征

3 卵巢颗粒细胞凋亡途径

4 卵巢颗粒细胞凋亡调控蛋白

5 细胞凋亡检测方法

6 结语

参考文献

第二章 Smad家族与Smad4基因研究进展

1 Smad家族的分类与结构

2 Smad与TGF-β超家族

3 Smad4研究进展

4 Smad4其它功能

5 结语

参考文献

第三章 RNA interference研究进展及应用现状

1 RNA: interference(RNAi)现象的发现

2 RNAinterference( RNAi)的作用机制

3 RNAinterference(RNAi)的基本实验程序

4 RNAinterference(RNAi)的应用

5 结语

参考文献

实验研究

第四章 Smad4-siRNA转染猪卵巢颗粒细胞及其效率检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结语

参考文献

第五章 RNAi抑制Smad4表达对颗粒细胞凋亡的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结语

参考文献

第六章 RNAi抑制Smad4表达对细胞凋亡调控因子Bcl-2及Bax的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结语

参考文献

全文结论

附录

致谢