河豚鱼成分荧光PCR检测方法建立及应用

摘要

河豚鱼肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,享有“鱼中之王”的美誉,备受美食家的青睐。但是河豚鱼内脏、卵巢、血液、鱼皮、鱼头等部位含有剧毒,如加工处理不当或误食常会引起中毒,甚至死亡。一般人由于没有相关的专业知识,有时也会因为不能识别河豚鱼而误食引起中毒死亡,尤其是对于各种已经加工成鱼片、鱼糜等产品,很难靠人的感观来识别的；近年来,有人故意或无意地把河豚鱼下脚料加工成鱼片或鱼糜,混在其他鱼产品中,销售到市场,甚至是国外,引起了食物中毒事件,这在一定程度上影响了我国的鱼糜制品的销售信誉。本研究的目的是采用荧光PCR方法,建立了简便、快速、准确的河豚鱼成分检测方法,用于相关鱼产品的检测。
　　 细胞色素B基因常用于鱼类的分类、亲缘关系、鱼类物种鉴定、系统发育的标记等,本课题根据河豚鱼细胞色素B基因序列,设计并合成引物和探针,从河豚鱼细胞(组织)中提取DNA,扩增细胞色素B基因片段,回收PCR扩增片段,克隆到pGEM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,抽提质粒,梯度稀释作为阳性标准品,用于标准曲线的制定和样品检测,通过优化Mg2+、酶等反应条件,建立了实时荧光定量PCR技术平台,并对其有效率、敏感性、特异性进行了检测。该检测技术对检测河豚鱼成分灵敏度可以达到100拷贝数左右,对暗鳍腹刺魨、黑腮兔头魨、棕斑腹刺魨、阳性质粒、青占鱼、竹荚鱼、鱿鱼、带鱼、三文鱼等进行特异性试验,结果只有暗鳍腹刺魨黑腮兔头魨、棕斑腹刺魨、阳性质粒出现了扩增曲线。在鱼糜中混入一定量的河豚鱼鱼糜,采用五点采样法和常规采样法进行模拟样品的检测,其结果五点采样法灵敏度高于常规采样法,检测灵敏度为50g带鱼鱼糜中添加1g河豚鱼鱼糜。结果证明,我们建立的实时荧光定量PCR技术平台可以用来快速检测河豚鱼成分。
　　 利用建立的实时荧光定量PCR技术平台,进行模拟样品和35份宁波地区的出口的鱼糜检测,检测结果均为阴性。在宁波地区出口的鱼糜中没有检出河豚鱼成分。