春石斛品种(系)亲缘关系的AFLP分析与转基因研究

摘要

石斛属（Dendrobium）是兰科（Orchidaceae）中最大的属，全球约1500余个野生原种，广泛分布于世界热带、亚热带地区，其中原产我国的有70余种，目前在药用和鲜切花、盆花栽培中广泛应用。春石斛(Spring Dendrobium)在园艺上是指石斛兰中花着生于叶腋，主要自然花期在春季的石斛种或者品种，是目前世界兰花市场最重要的热带兰盆栽花卉之一。为了创制更多有观赏价值的春石斛新品种，在生产和研究上都急需完善相关的育种技术体系。但是采用分子标记技术分析春石斛品种间亲缘关系，和建立稳定高效转化体系并通过转化得到符合目的性状新品种的研究目前均较少。
　　 本研究根据春石斛主要栽培品种的特点，首先采用AFLP分子标记技术，研究了30个主要栽培品种（系）的亲缘关系，并以其中的一个重要栽培品种(‘Sanya’)作为受体材料构建了其类原球茎的再生体系，采用超声波辅助农杆菌诱导法（SAAT）进行CHS和ASACC基因的遗传转化。主要研究结果如下:
　　 1.采用改良的CTAB法，在进行细胞核裂解之前先加入核分离缓冲液，成功提取出高品质的春石斛基因组DNA，OD260nm/OD280nm的比率为1.73-1.85。与试剂盒法和普通CTAB法相比，该方法提取的基因组DNA不仅基本排除了春石斛体内多糖及其它次生代谢物质对基因组DNA质量的干扰，得率也较高，完全能满足AFLP等分子生物学试验对DNA质量的要求。
　　 2.利用荧光AFLP技术分析了30个春石斛栽培品种（系）的亲缘关系。选择EcoRⅠ/MseⅠ酶切组合，8对引物组合的选择性扩增共得到1102个条带，其中多态性带占70.6％。利用NTSYS pc Version2.0e软件对扩增数据进行分析，用主坐标分析法(PCOA)和算术平均数的加权配对归类法(UPGMA)等方法对扩增数据进行品种间的亲缘分析，30个品种或品系材料可分为5个类群，类群Ⅰ包含6个品种（系），相似系数在0.70-0.80之间;类群Ⅱ包含3个品种（系），相似系数在0.71-0.76之间;类群Ⅲ包含的品种（系）最多，共13个，其相似系数在0.69-0.84之间;类群Ⅳ包含了7个品种，相似系数在0.68-0.83之间;而类群Ⅴ仅包含了‘Santana Canary’一个品种。
　　 3.建立了春石斛品种‘Sanya’和‘China Doll’类原球茎(PLBs)的再生体系。首先通过盆栽植株的茎尖或腋芽外植体诱导得到无菌苗;再以无菌苗茎基无叶芽茎段为材料，经40 KHz超声波预处理10 min，接于1/2 MS+6-BA0.2 mg/L固体培养基上，两个品种分别得到最高10.5％和9％的PLBs诱导率。系列筛选试验表明，采用液体MS+6-BA0.2 mg/L两品种的PLBs增殖率均最高，分别为4.57倍/月和4.31倍/月;采用1/2 MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.2mg/L固体培养基，芽增殖率最高分别为2.90和2.66，这两个春石斛品种的PLBs诱导率与其它品种间存在显著性差异。
　　 4.采用超声波辅助农杆菌介导法(SAAT)成功地将CHS和ASACC基因导入春石斛品种‘Sanya’的类原球茎中，获得转基因株系。采用农杆菌共侵染60 min结合超声波40 KHz辅助诱导处理10min，在预培养、共侵染和共培养中均添加100μM AS的处理组合，可使‘Sanya'获得最高的转化率。通过Km200 mg/L的筛选，两个基因的转化分别得到63和64个抗性株系，通过GUS、PCR和Southern bolt检测，获得20个转CHS基因株系和10个转ASACC基因株系，最高转化率分别为1.17％和1.04％。经荧光定量RT-PCR检测，其中4个转CHS基因和2个转ASACC基因株系的目的基因相对表达量均显著高于未转化对照，且各株系之间也存在差异，转CHS基因的株系A1和转ASACC基因的B3株系表现出最高的目的基因表达效率。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

1 研究思路

2 技术路线

第一部分 文献综述

第一章 AFLP分子标记技术及其在观赏植物研究中的应用

1 AFLP技术简介

2 AFLP技术在观赏植物品种研究上的应用

3 AFLP技术在观赏植物辅助育种上的应用

4 兰科植物分子标记技术研究进展

第二章 植物乙烯生物合成调控和花色改良的基因工程研究进展

1 乙烯生物合成相关基因

2 植物花色及CHS基因

3 兰花植物遗传转化研究进展

4 超声波在农杆菌介导遗传转化上的应用

5 荧光定量RT-PCR技术在转基因鉴定中的应用

第二部分 试验研究

第一章 基于AFLP的春石斛品种(系)间亲缘关系分析

第一节 春石斛基因组DNA的提取技术研究

第二节 春石斛品种(系)亲缘关系的AFLP分析

第二章 春石斛的类原球茎(PLBs)再生与遗传转化研究

第一节 超声波辅助诱导的春石斛类原球茎再生

第二节 超声波辅助农杆菌介导的CHS基因转化春石斛品种‘Sanya’的研究

第三节 超声波辅助农杆菌介导ASACC基因转化春石斛‘Sanya’的研究

全文结论

创新点

参考文献

攻读博士期间发表的文章

致谢