芳氧苯氧丙酸酯类除草剂多残留酶联免疫分析方法研究

摘要

为研究农药多残留酶联免疫分析方法，本研究以精恶唑禾草灵和氰氟草酯为研究对象，合成了精恶唑禾草灵半抗原(fenoxaprop-p)和氰氟草酯半抗原(cyhalofop-p)。采用碳二亚胺法将精恶唑禾草灵半抗原和氰氟草酯半抗原依次与载体蛋白BSA偶联，制备得到多决定簇人工免疫原，紫外光谱分析证明偶联成功。精恶唑禾草灵半抗原、氰氟草酯半抗原与BSA偶联比分别为9.2∶7.8∶1，通过混合酸酐法将两半抗原和OVA偶联作为包被抗原。以多决定簇免疫原免疫雄性新西兰大白兔，获得高亲和性的宽谱特异性抗体，对精恶唑禾草灵和氰氟草酯的亲和常数分别为5×109和7.5×109，间接竞争酶联免疫吸附测定法(ic-ELISA)测定冻干粉对精恶唑禾草灵和氰氟草酯的效价分别为5.12×105和1.02×106。
　　 通过方阵滴定法筛选包被抗原和抗体的最适工作浓度，进一步研究了有机溶剂、pH值和离子强度在间接竞争ELISA中对精恶唑禾草灵和氰氟草酯与抗体亲和作用的影响，确定了精恶唑禾草灵和氰氟草酯ic-ELISA法的最佳条件。确定了30％的甲醇和pH7.5、0.5 mol/L钠离子强度的磷酸盐缓冲液为精恶唑禾草灵和氰氟草酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法的最佳工作条件。
　　 在优化条件下，利用制备的宽谱特异性抗体建立了精恶唑禾草灵和氰氟草酯ic-ELISA方法。精恶唑禾草灵ic-ELISA抑制反应曲线在0.005～5 mg/L标样浓度范围与抑制率有较好线性关系，标准曲线的回归方程为y=-24.799 x+31.816，R2=0.9975，IC50为0.185 mg/L，LOD(IC10)为0.004 mg/L。氰氟草酯ic-ELISA抑制反应曲线在0.005～1 mg/L标样浓度范围与抑制率有较好线性关系，标准曲线的回归方程为y=-30.776 x+8.422,R2=0.9956,IC50为0.045 mg/L,LOD(IC10)为0.002 mg/L。制备的抗体对氰氟草酯的交叉反应率是411.1％，对恶唑酰草胺的交叉反应率是55.56％，该抗体与其它结构类似的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂没有明显的交叉反应。
　　 以建立的ic-ELISA分析方法，进行了水、土壤、稻米和大豆中的添加回收率试验，添加浓度为0.05mg/L(mg/kg)～1mg/L(mg/kg)，精恶唑禾草灵的添加回收率为86.86％114.52％，变异系数为0.72％～9.32％;氰氟草酯的添加回收率为82.07％119.11％，变异系数为1.23％～7.75％;恶唑酰草胺的添加浓度是0.1 mg/L(mg/kg)～1 mg/L(mg/kg)，添加回收率为82.51-114.46％，变异系数为1.03％～8.18％，本研究建立的ELISA方法均符合农残分析的要求。
　　 分别用宽谱特异性抗体、混合抗体检测氰氟草酯和精恶唑禾草灵混合物的残留量，两种检测方法的IC50分为0.501 mg/L和0.344 mg/L。宽谱特异性抗体测定两种农药的最低检测限为0.017 mg/L，在自来水、河水、土壤、稻米样品中的添加回收率为77.6～118.2％，变异系数为1.5～7.0％;混合抗体测定两种农药的最低检测限为0.039mg/L，在自来水、河水、土壤、稻米中的添加回收率为79.1～118.1％，变异系数为1.5～8.9％。
　　 本研究建立了芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的多残留酶联免疫分析方法。该方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求，可适用于大量样本和现场样本的快速检测，为开发残留检测试剂盒及农药多残留酶联免疫分析奠定了理论基础。

目录

声明

摘要

缩略语

第一章 文献综述

1．农药酶免疫分析技术

1．1 农药酶免疫分析技术研究进展

1．2 农药酶免疫分析方法建立

2．农药多残留测定技术及其发展趋势

2．1 气相色谱法及其联用技术

2．2 液相色谱法及其联用技术

2．3 酶免疫分析技术

3．芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的概述

3．1 芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的发展及使用概况

3．2 芳氧苯氧丙酸酯类除草剂的作用机制及特点

4．本研究的目的和意义

第二章 多决定簇人工抗原合成及宽谱特异性抗体的制备

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 半抗原的合成

1．3 人工抗原的制备与鉴定

1．4 宽谱特异性多克隆抗体的制备和纯化

2．结果与分析

2．1 半抗原分子的结构鉴定

2．2 人工抗原偶联物结合比的测定

2．3 多克隆抗体的效价

2．4 亲和常数的测定

3．讨论

第三章 芳氧苯氧丙酸酯类除草剂多残留ELISA方法建立

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 包被抗原及抗体最适工作浓度选择

1．3 间接竞争ELISA标准曲线的建立

1．4 间接竞争ELISA分析方法的条件优化

1．5 交叉反应率的测定

1．6 添加回收率测定

2．结果与分析

2．1 包被抗原及抗体最适工作浓度选择

2．2 ic-ELISA分析条件的优化

2．3 标准曲线的建立

2．4 交叉反应

2．5 添加回收率的测定

3．讨论

3．1 ic-ELISA分析条件的优化

3．2 方法的灵敏度

3．3 方法的特异性

3．4 方法的准确度和精密度

第四章 精恶唑禾草灵与氰氟草酯总量测定及条件探讨

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

1．2 宽谱特异性抗体测总量最佳工作条件探讨

1．3 混合抗体测总量最佳工作条件探讨

1．4 标准曲线绘制

1．5 添加回收率测定

2．结果与分析

2．1 宽谱特异性抗体ELISA分析条件的优化

2．2 混合抗体ELISA分析条件的优化

2．3 标准曲线绘制

2．4 添加回收率测定

3 结论与讨论

全文主要结论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表的论文