普通小麦中一类富含脯氨酸蛋白基因的克隆与功能分析

摘要

小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是一种由禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)引起的、严重危害小禾谷类和玉米等作物的真菌性病害。随着全球性气候变暖、耕作制度和方式的改变，小麦赤霉病呈蔓延扩展趋势。自20世纪50年代开始，国内外学者就针对小麦赤霉病病原菌的致病菌种、致病性、致病机理及抗源筛选、抗性鉴定技术、抗赤霉病性遗传、抗病基因定位、抗性生理生化机制、抗性育种等方面做了大量研究，然而有关小麦抗赤霉病相关基因克隆的研究报道很少。
　　 本研究以高抗赤霉病小麦品种望水白和快中子诱导产生的一个望水白感赤霉病突变体NAUH117为材料，基于基因芯片技术，筛选、克隆赤霉病抗病相关基因并验证其功能。主要研究结果如下：
　　 1、利用Affymetrix小麦基因芯片筛选高抗赤霉病小麦品种望水白和NAUH117经赤霉菌诱导后穗组织的差异表达基因，其中三个编码富含脯氨酸蛋白(Proline RichProtein，PRP)的探针在NAUH117中受到赤霉菌诱导后显著下调表达，推测PRP基因是赤霉菌与寄主建立亲和关系过程中受调控的重要基因，可能参与了望水白对赤霉病菌侵染的抗性反应。
　　 2、根据芯片上的编码PRP的三个探针设计引物，通过RACE的方在望水白中克隆了三个同源的TαPRP基因；利用一套普通小麦中国春的缺体.四体系将三个TαPRP基因分别定位在小麦3B、3A和3D染色体上，分别命名为TαPRP1、TαPRP2和TαPRP3，其中TαPRP1基因cDNA全长945bp，编码171个aa；TαPRP2基因cDNA全长932bp，编码159个aa；TαPRP3基因cDNA全长991bp，编码155个aa。氨基酸序列分析发现，三个TaPRP基因编码的蛋白质都含有N末端信号肽，推测其为一类分泌蛋白。
　　 3、构建了三个TaPRP全长基因与GFP基因的融合表达载体，利用基因枪轰击洋葱表皮细胞，根据绿色荧光信号的检测结果推测：TαPRP1、TαPRP3蛋白为核蛋白，而 TαPRP2则分布于整个细胞中。
　　 4、为了进一步阐明TαPRP基因在小麦抗赤霉病中的功能，构建了TαPRP基因的表达载体，利用基因枪法将TαPRP基因导入到中感赤霉病的小麦品种扬麦158幼胚愈伤组织，获得136株T0代转基因植株，通过PCR的方法鉴定出4株阳性转基因植株。对T0代进行田间赤霉病抗性鉴定的初步结果表明，TαPRP3的过量表达可使扬麦158的赤霉病抗性得到一定程度的提高。