β-葡聚糖增强大鼠乳腺上皮细胞的自主防御及其机制研究

摘要

本实验选用健康SD大鼠，旨在利用LPS诱发实验性大鼠乳腺炎模型，研究β-葡聚糖对大鼠乳腺防御机能的影响和保护效应;在此基础上，揭示大鼠乳腺上皮细胞对LPS作用的自主防御反应，并深入研究和阐明β-葡聚糖增强大鼠乳腺上皮细胞自主防御的作用以及机制。结果如下:
　　 1β-葡聚糖通过激活Dectin1对人工诱导实验性乳腺炎大鼠的保护利用LPS诱导的实验性乳腺炎大鼠模型研究β-葡聚糖对动物乳腺的保护。自怀孕第10天起，实验组大鼠灌喂生理盐水（阳性对照组，PC，n=8）、0.1 mg/kg·dβ-葡聚糖（低剂量组，PL，n=8）、1 mg/kg·dβ-葡聚糖（中剂量组，PM，n=8）、10 mg/kg·dβ-葡聚糖（高剂量组，PH，n=8），对照组大鼠灌喂生理盐水（阴性对照组，NC，n=8），连续灌喂10天。产后72 h分别灌注灭菌生理盐水至对照组和10μg/侧LPS到实验组大鼠第四对乳腺（两侧）内，12 h后处死大鼠，采集乳腺组织和血清用于相关指标的测定和分析。结果表明:LPS能显著增加大鼠乳腺Dectin1(P＜0.05)和TLR4(P＜0.05)的mRNA和蛋白的表达水平;显著增加大鼠乳腺及血清中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosisfactor-α，TNF-α)(P＜0.05)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(P＜0.05)的浓度，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase)(P＜0.05)、诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOs)(P＜0.05)及髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)(P＜0.05)的活性。与阳性对照组相比，灌喂β-葡聚糖能显著增强Dectin1的mRNA和蛋白的表达，降低TLR4的mRNA和蛋白的表达;降低大鼠乳腺及血清中TNF-α、IL-1β的浓度，大鼠乳腺NAGase、iNOs、MPO的活性，但能提高大鼠血清中白细胞介素-2(IL-2)的浓度。形态学观察也发现，β-葡聚糖处理组的乳腺腺泡内仅见少量的PMN浸润，且乳腺的泌乳功能得以恢复。结果显示，β-葡聚糖能通过激活Dectin1受体最终产生对实验性乳腺炎大鼠的保护效应。
　　 2大鼠乳腺上皮细胞对LPS的自主防御反应与β-葡聚糖的保护效应研究利用LPS与原代培养的大鼠乳腺上皮细胞共孵育研究乳腺上皮细胞的自主防御反应和β-葡聚糖产生的保护效应。设置实验组为阳性对照组(PC，等量DMSO，n=5)、低剂量组(PL，1μg/mLβ-葡聚糖，n=5)、中剂量组(PM，5μg/mLβ-葡聚糖， n=5)、高剂量组(PH，25μg/mLβ-葡聚糖，n=5)以及阴性对照组（NC，等量DMSO，n=5），处理细胞12h。更换无血清培养液，10μg/mL LPS处理实验组细胞40min，收集细胞及细胞液。与阴性对照组相比，LPS能显著提高CD14(P＜0.05)、MD2(P＜0.05)的mRNA表达;显著提高TLR4(P＜0.05)的mRNA和蛋白表达;显著提高MyD88(P＜0.05)、Dectin1(P＜0.05)的蛋白表达;显著降低IκBα(P＜0.05)、β-casein(P＜0.05)的蛋白表达;显著提高NF-κB的转录活性(P＜0.05）;显著提高TNF-α(P＜0.05)和IL-1β(P＜0.05)的浓度。与阳性对照组相比，所有剂量组β-葡聚糖能显著降低CD14(P＜0.05)、MD2(P＜0.05)的mRNA表达;低剂量组和高剂量组β-葡聚糖能显著降低TLR4(P＜0.05)、MyD88(P＜0.05)的蛋白表达;所有剂量组β-葡聚糖能显著提高Dectin1(P＜0.05) mRNA和蛋白表达;所有剂量组β-葡聚糖能显著提高Syk(P＜0.05)及β-casein(P＜0.05)的蛋白表达;中剂量组和高剂量组能显著提高IκBα(P＜0.05)的活性及显著降低NF-κB(P＜0.05)的转录活性;所有剂量组β-葡聚糖能显著渐少TNF-α(P＜0.05）和IL-1β(P＜0.05)的分泌。结果表明LPS能上调大鼠乳腺上皮细胞TLR4/MyD88/IκBα(-)/NF-κB通路，β-葡聚糖则能通过上调Dectin1/Syk/IκBα(-)通路，下调TLR4/MyD88/IκBα(-)通路，降低NF-κB的转录活性，减少炎性细胞因子的分泌，恢复乳腺上皮细胞β-casein的分泌水平，并具有剂量依赖性。
　　 3β-葡聚糖对大鼠乳腺上皮细胞自主防御信号通路相关蛋白表达时序的影响利用LPS与原代培养的大鼠乳腺上皮细胞共孵育研究β-葡聚糖调节大鼠乳腺上皮细胞自主防御的信号通路，并分析通路相关蛋白表达的时序。设置实验组加入5μg/mLβ-葡聚糖，对照组加入等量DMSO处理细胞12h。更换无血清培养液，10μg/mLLPS处理所有细胞0、0.5及1h，于各个时间点收集细胞及细胞培养液。相比0h对照组，LPS作用0.5h（P＜0.05）、1h(P＜0.05)能显著提高乳腺上皮细胞TLR4、MyD88、及Syk的蛋白表达，且TLR4及MyD88的表达在0.5h达到峰值;LPS作用0.5h(P＜0.01)、1h(P＜0.01)能极显著降低IκBα的表达;LPS作用0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)显著提高NF-κB的转录活性;LPS作用0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)显著提高TNF-α的浓度且在0.5h达到峰值。与对应时间点对照组相比，β-葡聚糖能显著降低LPS共孵育0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)的乳腺上皮细胞MyD88的蛋白表达;显著提高0.5h(P＜0.05)Dectin1的蛋白表达;显著提高0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)Syk及IκBα的蛋白表达;显著降低0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05) NF-κB的转录活性;显著降低0.5h（P＜0.05）、1h(P＜0.05) TNF-α的分泌。此外，LPS作用0.5h能极大增强乳腺上皮细胞TLR4的荧光表达，β-葡聚糖能极大增强LPS作用0.5h乳腺上皮细胞Dectin1的荧光表达。LPS能通过激活大鼠乳腺上皮细胞TLR4的表达，促进胞内适应子蛋白MyD88的活化，从而激活NF-κB的转录活性;β-葡聚糖能通过激活大鼠乳腺上皮细胞Dectin1的表达，激活胞内Syk的活性并拮抗胞内适应子蛋白MyD88的活化，降低NF-κB的转录活性，减少炎性细胞因子的分泌。
　　 4β-葡聚糖调节大鼠乳腺上皮细胞TLR-4及Dectin1信号通路的机理研究分别用TLR-4抑制剂5μmol/L、Syk抑制剂150 nmol/L以及NF-κB抑制剂10μmol/L预处理原代培养的大鼠乳腺上皮细胞2h，更换无血清培养液。实验分组设置为:对照组加入等量DMSO，实验组1单独加入5μg/mLβ-葡聚糖，实验组2加入等量DMSO及实验组3加入5μg/mLβ-葡聚糖，处理细胞12h。再更换无血清培养液，对照组加入等量DMSO，实验组1加入等量DMSO，实验组2单独加入10μg/mL LPS及实验组3加入10μg/mL LPS，所有细胞处理0、0.5、1及2h，收集细胞及细胞培养液。研究β-葡聚糖、LPS对3种抑制剂预处理的乳腺上皮细胞的影响，重点分析相关信号通路发生的变化。
　　 在TLR4被抑制条件下，相比0h对照组，实验组1能显著提高所有时间点Syk(P＜0.05)的蛋白表达及0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及1h(P＜0.05) Dectin1(P＜0.05)的蛋白表达，且都在1h达到峰值;实验组2能显著提高所有时间点TLR-4(P＜0.05)及MyD88(P＜0.05)的蛋白表达，其中TLR-4在0.5h达到峰值，MyD88在1h达到峰值，显著降低0h(P＜0.05)及0.5h(P＜0.05) IκBα的表达，极显著提高所有时间点NF-κB(P＜0.01)的转录活性且保持稳定，显著提高0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) TNF-α和1h(P＜0.05) IL-1β的浓度;实验组3能显著提高所有时间点Dectin1(P＜0.05)的蛋白表达，显著提高0h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) Syk的蛋白表达，显著提高所有时间点NF-κB(P＜0.05)的转录活性，其中0.5h(P＜0.01)及1h(P＜0.01)差异极显著。与同时间点实验组2进行比较，实验组1所有时间点Syk(P＜0.05)的蛋白表达及0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及1h(P＜0.05) Dectin1(P＜0.05)的蛋白表达显著提高，所有时间点TLR-4(P＜0.05)及MyD88(P＜0.05)的蛋白表达显著降低，0h(P＜0.05)及0.5h(P＜0.05)IκBα的表达显著提高，所有时间点NF-κB(P＜0.01)的转录活性极显著降低，0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) TNF-α和1h(P＜0.05)IL-1β的浓度显著降低;实验组3所有时间点Dectin1(P＜0.05)的蛋白表达及0h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05)Syk的蛋白表达显著提高，0h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) NF-κB(P＜0.05)的转录活性显著降低，其他同实验组1。
　　 在Syk被抑制条件下，相比0h对照组，实验组1能显著提高所有时间点Dectin1(P＜0.05)的蛋白表达，显著提高1h(P＜0.05)、2h(P＜0.05)Syk(P＜0.05)的蛋白表达;实验组2能显著提高所有时间点TLR4(P＜0.05)及0.5h(P＜0.05) MyD88的蛋白表达，显著降低2h(P＜0.05)IκBα的表达，极显著提高0.5h(P＜0.01)、1h（P＜0.01）及2h(P＜0.01) NF-κB的转录活性，显著提高0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05) TNF-α和0.5h(P＜0.05) IL-1β的浓度;实验组3能显著提高所有时间点Dectin1(P＜0.05)的表达，显著提高1h（P＜0.05）及2h(P＜0.05) Syk的表达，极显著提高0.5h(P＜0.01)、1h(P＜0.01)及2h（P＜0.01）NF-κB的转录活性。与同时间点实验组2进行比较，实验组1所有时间点Dectin1(P＜0.05)的蛋白表达及1h(P＜0.05)、2h(P＜0.05) Syk(P＜0.05)的蛋白表达显著提高，所有时间点TLR4(P＜0.05)及0.5h(P＜0.05) MyD88的蛋白表达显著降低，2h（P＜0.05）IκBα的表达显著提高，0.5h(P＜0.01)、1h(P＜0.01)及2h(P＜0.01)NF-κB的转录活性极显著降低，0.5h(P＜0.05)、1h（P＜0.05）TNF-α和0.5h(P＜0.05) IL-1β的浓度显著降低;实验组3MyD88在0.5h的蛋白表达有所降低，但差异不显著，0.5h、1h及2h NF-κB的转录活性差异不显著，其他同实验组1。
　　 在NF-κB被抑制条件下，相比0h对照组，实验组1能显著提高0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及极显著提高1h(P＜0.01) Dectin1和Syk的蛋白表达，显著提高1h(P＜0.01)TLR4的蛋白表达;实验组2能显著提高所有时间点TLR4(P＜0.05)的蛋白表达且在0.5h达到峰值，显著提高所有时间点MyD88的蛋白表达且在1h达到峰值，显著降低1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05)IκBα的表达，显著提高0.5h(P＜0.05)、1h（P＜0.05）NF-κB的转录活性，显著提高0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) TNF-α和0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05) IL-1β的浓度;实验组3能显著提高0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05) Dectin1(P＜0.05)的表达，显著提高所有时间点Syk的蛋白表达，显著提高0.5h(P＜0.05)、2h(P＜0.05)及极显著提高1h(P＜0.01) NF-κB的转录活性。与同时间点实验组2进行比较，实验组1能显著提高0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及1h(P＜0.05) Dectin1和Syk的蛋白表达，0h(P＜0.05)、0.5h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) TLR4的蛋白表达显著降低，所有时间点MyD88的蛋白表达显著降低，1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05)IκBα的表达显著提高，0.5h（P＜0.05）、1h(P＜0.05) NF-κB的转录活性显著降低，0.5h（P＜0.05）、1h（P＜0.05）及2h（P＜0.05）TNF-α和1h(P＜0.05)IL-1β的浓度显著降低;实验组3在0.5h(P＜0.05)、1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05) TLR4和MyD88的蛋白表达显著降低，所有时间点Syk的蛋白表达显著提高，1h(P＜0.05)及2h(P＜0.05)NF-κB的转录活性显著提高，其他同实验组1。
　　 在乳腺上皮细胞中TLR-4被抑制后，对Dectin1/Syk通路无明显抑制作用，对NF-κB的活性有一定的抑制作用;在Syk激酶被抑制后，对TLR-4/MyD88通路及NF-κB的活性无明显抑制;在乳腺上皮细胞中抑制NF-κB后，对Dectin1/Syk及TLR-4/MyD88通路无明显抑制。总体来说，在乳腺上皮细胞中分别使用三种抑制剂时，β-葡聚糖单独作用可激活Dectin1/Syk通路，LPS单独作用可激活TLR-4/MyD88通路，β-葡聚糖和LPS共同作用则可抑制TLR-4/MyD88通路，激活Dectin1/Syk通路。

目录

声明

摘要

本文部分缩写中英文对照

引言

第一篇 文献综述

第一章 乳腺免疫的固有防御因素

1 乳腺固有防御系统

2 乳腺内可溶性抗菌成分

3 乳腺固有免疫受体

第二章 乳腺健康调节的研究进展

1 引起乳腺炎症的因素

2 乳腺健康调节的研究现状

3 乳腺固有免疫调节的信号通路

第三章 β-葡聚糖的免疫调节机理研究

1 β-葡聚糖的来源及结构

2 β-葡聚糖的吸收

3 β-葡聚糖的主要功效

4 β-葡聚糖的作用机制

参考文献

第二篇 试验研究

第一章 β-葡聚糖通过激活Dectin1对人工诱导实验性乳腺炎大鼠的保护

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第二章 大鼠乳腺上皮细胞对LPS的自主防御反应与β-葡聚糖的保护效应研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第三章 β-葡聚糖对大鼠乳腺上皮细胞自主防御信号通路相关蛋白表达时序的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

第四章 β-葡聚糖调节大鼠乳腺上皮细胞TLR-4及Dectin1信号通路的机理研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

参考文献

总体讨论

参考文献

全文结论

本文创新点

致谢

博士期间发表和完成的论文