β-葡聚糖抗SD大鼠实验性肝纤维化作用及其机制研究

摘要

β-葡聚糖抗SD大鼠实验性肝纤维化作用及其机制研究一、研究背景肝纤维化是各种慢性肝病肝硬化发展的必经阶段。病毒、乙醇、寄生虫、铜铁沉积、化学毒物、肝内胆汁淤积以及营养不良等原因长期反复作用，导致慢性肝损伤，引发以胶原为主的细胞外基质(ECM)合成增多，降解相对不足，在肝内过多沉积引起肝纤维化。 传统的观点认为，肝纤维化不可逆转。近年来，随着医学科学的进步和发展，对于肝纤维化逆转方面的研究已取得突破性进展。著名肝病学家Roking明确提出，人典型发生的肝硬化完全可以发生逆转。因此，关于肝纤维化发生机制以及肝纤维化治疗等方面的研究成为近十多年来世界医学攻关中的热点。 目前，临床上有效的抗肝纤维化药物不多，秋水仙喊、糖皮质激素、青霉胺等抗肝纤维化的药物临床疗效不十分肯定，且严重的副作用较多，从而限制了其在临床的广泛应用。中草药抗肝纤维化的研究一直比较活跃。迄今为止，已经发现一些中草药具有抗肝纤维化的作用。 大量的研究已经证实，具有抗氧化作用的营养素如维生素A、E、C、硒、牛磺酸等具有预防肝纤维化的作用。因为营养因素预防和治疗肝纤维化具有安全、副作用小、可长期坚持等优点，因此，开发研究具有抗肝纤维化作用的营养素及营养活性成分具有十分重要的应用价值。 β-葡聚糖是从大麦以及燕麦中提取的一种低聚糖，属于可溶性食物纤维，已有实验研究证实β-葡聚糖具有抗氧化、降血脂、降血糖、保护肝脏功能、促进肠道益生菌生长等作用，关于其是否具有抗肝纤维化作用未见报道。 本课题基于现今关于肝纤维化的最新研究进展，用CCl4茶油溶液腹腔注射8w制备SD大鼠肝纤维化模型，然后进行为期8w的β-葡聚糖干预实验研究，观察β-葡聚糖对改善肝纤维化大鼠肝功能、肾功能、营养状况、病理改变等以及β-葡聚糖对肝纤维化大鼠抗氧化作用、抑制炎症反应作用进行研究，并采用目前最先进的实时荧光定量PCR技术研究β-葡聚糖对纤维化大鼠肝脏Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达调控作用，以及其对肝纤维化信号传导过程中smad3mRNA、smad7mRNA的表达调控，研究β-葡聚糖对实验动物肝纤维化的治疗作用及作用机制，为人类开发具有预防和治疗肝纤维化的功能性保健食品提供科学的依据。 二、研究目的 1.观察β-葡聚糖对纤维化大鼠肝功能的改善作用。 2.研究β-葡聚糖对肝纤维化大鼠的纤维化逆转作用。 3.研究β-葡聚糖抗肝纤维化作用机制。 4.为人类开发具有预防和治疗肝纤维化的功能性保健食品提供理论依据。 三、研究方法 1.动物实验 (1)造模方法80只SD雄性大鼠随机分为2组：对照组及模型组。模型组70只腹腔注射40％CCl4油溶液，造模剂量2ml/kg，每w2次首次剂量未加倍。对照组10只采用相等量的生理盐水腹腔注射每周2次。分别于造模后第4w、第6w及第8w时抽取3只肝纤维化组大鼠及2只正常对照组大鼠进行超声检查，监测肝纤维化形成的情况。 (2)干预分组及方法造模8w后经病理切片证实肝纤维化形成。取存活的28只肝纤维化模型组动物随机分为未经治疗的阳性对照组10只、秋水仙碱治疗组8只和β-葡聚糖治疗组10只。另9只未造模的正常大鼠为空白对照组。实验期间，β-葡聚糖组每天用浓度为5％β-葡聚糖溶液灌胃，剂量10ml/kg；秋水仙碱组采用0.2g/kg的秋水仙碱溶液灌胃，阳性对照组和空白对照组用10ml/kg的生理盐水灌胃。 1.生化检测：观察β-葡聚糖对纤维化大鼠肝、肾功能、蛋白合成的改善作用。采用日本日立7600-020型全自动生化分析仪检测各组大鼠血清ALT、AST、AKP、γ-GT、总胆汁酸、直接胆红素、总胆红素、血清总蛋白、白蛋白、前白蛋白、视黄醇结合蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸、钾、钠、氯、钙、磷、镁、铁等指标。 2.病理观察：采用HE染色及胶原染色观察β-葡聚糖对纤维化大鼠的肝病理改变。 3.检测抗氧化酶学指标：采用试剂盒检测血清SOD、MDA水平改变。 4.细胞因子检测：免疫组化方法检测大鼠血清TNF-α、IL-2表达情况改变。 5.表达调控检测：采用实时荧光定量PCR技术检测β-葡聚糖对纤维化大鼠肝脏Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达调控作用，以及其对肝纤维化信号传导过程中smad3mRNA、smad7mRNA的表达调控，以及PPAR-αmRNA、TNF-αmRNA表达的影响。 四、研究结果 1.动物实验干预研究 (1)β-葡聚糖可以改善肝纤维化大鼠的肝功能，β-葡聚糖治疗组血清ALT、AST、AKP、γ-GT、总蛋白、白蛋白、球蛋白、以及总胆汁酸、直接胆红素、总胆红素以及肾功能指标BUN、Cr均较肝纤维化阳性对照组有所改善。 (2)β-葡聚糖可以预防和治疗CCl4所致大鼠肝纤维化。 2.β-葡聚糖治疗肝纤维化机制研究(1)β-葡聚糖治疗组以及秋水仙碱治疗组SOD高于肝纤维化阳性对照组，而MDA及低于肝纤维化对照组。 (2)β-葡聚糖能够抑制血清IL-2表达： (3)β-葡聚糖治疗组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平明显低于阳性对照组。 (4)β-葡聚糖治疗smad3mRNA表达水平明显低于阳性对照组Smad7mRNA表达水平明显高于阳性对照组。 (5)β-葡聚糖治疗组TNF-αmRNA表达水平明显低于阳性对照组。 五、研究结论 1.成功地用40％CCl4茶油溶液腹腔注射复制了大鼠肝纤维化模型。 2.β-葡聚糖具有治疗和预防实验大鼠肝纤维化作用，其机制可能是通过改善和保护肝细胞功能、抑制炎症反应、下调肝纤维化大鼠Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达水平、下调smad3mRNA表达水平、上调smad7mRNA表达水平、以及下调TNF-αmRNA表达水平等途径发挥促进肝纤维化逆转作用。

目录

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英文缩略词

前 言

第一部分四氯化碳诱发SD大鼠肝纤维化模型复制

第二部分β-葡聚糖对CCl4所致大鼠肝纤维化实验研究

第三部分β-葡聚糖对肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及Smad3、7mRNA表达的影响研究

第四部分β-葡聚糖对肝纤维化大鼠IL-2、TNF-α及TNF-αmRNA表达的影响

第五部分β-葡聚糖对肝纤维化大鼠血清SOD、MDA以及PPAR-αmRNA表达影响的实验研究

小 结

综述 蛋白质组学在肝细胞和细胞器水平的研究进展

致 谢

个人简历及学习期间发表论文与著作