猪骨骼肌相关miRNA的鉴定及miR-378对肌肉发育调控的研究

摘要

肌肉的生长发育是一个复杂的过程:首先，成肌细胞在一系列的MRFs的调控下，由增殖阶段进入分化阶段，几个成肌细胞相互融合，形成多核的肌管，肌管进一步发育，细胞核逐渐向周围分散，最终形成肌纤维。越来越多的研究表明，miRNA对于不同阶段的肌肉发育都有着重要的调控作用，但是大多数的研究主要集中在miR-1、miR-133、miR-206等肌肉特异性miRNA中。为了筛选出更多与肌肉生长发育相关的miRNA，本研究利用solexa测序技术，鉴定骨骼肌中存在的miRNA。这对研究miRNA在骨骼肌中的生物学功能有着重要的指导作用。
　　 1.猪骨骼肌中miRNA的鉴定因为肌肉在发育的不同时期，具有不同的生理状态，而且参与其发育调控的基因也不同，这预示着在不同的发育阶段，miRNA表达的种类及丰度也有可能有着巨大的不同。在本研究中，为了尽可能全面的覆盖并鉴定出与肌肉生长发育相关的miRNA，与别人的研究相比，我们选取了更多的胚胎发育时间点，采集了怀孕期33、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105天，出生后0、10天，以及成年通城猪的背肌，制作总RNA混池，进行solexa测序。共得到23813176个总测序值，19937559个高质量的测序值。去除不含3'引物以及无插入片段的序列，去除含有polyA尾的序列、出现5'端污染的序列以及长度小于18nt的序列，共得到19854980个干净的sRNA序列。sRNA的长度主要分布在21～23 nt，并在22 nt处形成一个峰值。共有164783个unique sRNA以及15182311个total sRNA能与猪的基因组匹配，分别占各自总数的39.69％与76.47％。为了使每个unique sRNA有唯一的注释，按照rRNA(etc)＞已知miRNA＞重复序列＞外显子＞内含子的优先级顺序对sRNA进行分类注释，GenBank及Rfam两个数据库的优先级为GenBank＞Rfam。没有比对上任何注释信息的sRNA用于预测novel miRNA。最终得到了3407个unique miRNA、14034350个totalmiRNA，代表了172个成熟miRNA。通过与猪的基因组进行BLASTN比对，发现在solexa测序结果中有78个序列可能是novel miRNA。miRNA的“种子”序列对于靶基因的识别起着最关键的作用，在本研究鉴定出的所有miRNA中，有42个在“种子”序列内出现了单核苷酸突变。
　　 部分高丰度的成熟miRNA组织谱qPCR结果表明:ssc-miR-7a与ssc-miR-21在不同的组织中都有表达，说明此类miRNA在动物体内具有普遍的调控作用;ssc-miR-206只在骨骼肌中表达，而ssc-miR-1在骨骼肌与心肌中都有表达;ssc-miR-378在骨骼肌与心肌中的表达量明显高于其它组织，推断其在肌肉中可能具有比较重要的生物学功能;ssc-miR-10b在肌肉中也有较高的表达，但在肾中表达量最高;ssc-miR-181a在肌肉、脾、肾、小肠与结肠中的表达量都很高;ssc-miR-30d在肌肉与肾中的表达量较高;ssc-miR-127在肌肉与脾中的表达量较高;ssc-miR-143在结肠中表达较高;ssc-miR-148a在肝与结肠中表达较高;ssc-miR-30a在肾中的表达量较高;ssc-miR-199a在背肌中的表达量较高，而在腿肌中的表达量较低，可能是由于不同类型的骨骼肌中，Ⅱ型MyHC的含量不同造成的。
　　 本实验还采集了怀孕期33、65、90天，出生后0、10、100、180天以及成年通城猪的背肌，利用qPCR的方法检测了ssc-miR-378在不同的发育阶段背肌中的表达情况。发现ssc-miR-378在出生前总体的表达趋势是上升的，出生第0天达到最大表达量，出生以后，表达量逐渐下降，推测ssc-miR-378可能对胚胎期肌纤维的形成具有促进作用。
　　 2.miR-378在肌肉发育过程中的生物学功能小鼠mmu-miR-378的组织谱qPCR结果表明，mmu-miR-378在骨骼肌中的表达量较高，与猪的组织谱结果相类似，证明miR-378在猪与鼠的表达模式具有保守性，推测其在肌肉发育调控方面的功能也具有保守性。C2C12小鼠成肌细胞在分化的过程中，miR-378的表达逐渐增加，在分化的第2天达到最大，之后miR-378的表达量维持在一个相对稳定的水平，推测miR-378可能具有促进分化的作用。为了了解miR-378能够引起哪些下游基因及通路发生变化，本研究在C2C12中过表达miR-378，利用基因芯片筛选表达出现下调的基因，对所有2倍下调的基因进行GO及pathway分析，发现它们主要参与细胞的增殖、分化、凋亡、代谢以及离子转运等生物学过程，涉及了JAK-STAT、ErbB、MAPK等信号通路。GRB2同时存在于基因芯片下调基因及miR-378靶标基因预测结果中，荧光素酶报告载体系统证明miR-378可以调控GRB23'UTR，并且通过构建GRB23'UTR突变载体证实了miR-378的结合位点。GRB2是与细胞增殖相关的MAPK信号通路上游激活因子，miR-378可能通过下调该基因间接抑制MAPK通路，进而影响C2C12的增殖，促进分化。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

第一章 肌肉生长发育的研究现状

1 肌肉发育概述

2 肌肉发育过程中的重要基因及调控

3 影响肌肉发育的其它因素

参考文献

第二章 microRNA的研究进展

1 microRNA(miRNA)的发现

2 miRNA的产生机制

3 miRNA对靶基因的调控作用机制

4 miRNA的生物学功能

5 新一代测序技术在miRNA研究上的应用

6 miRNA靶标基因的筛选与鉴定

参考文献

第二部分 实验部分

第一章 利用solexa测序技术鉴定猪骨骼肌相关miRNA

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

第二章 miR-378在肌肉发育过程中的生物学功能研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

参考文献

全文结论

创新

致谢

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