猪应答猪肺炎支原体感染之特异性IgA抗体分泌规律的研究

摘要

猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mps又称猪气喘病)的主要病原。该病以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点，其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降，而且它能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障，从而引起其他致病菌的继发感染。当病原从黏膜途径侵入机体，主要刺激机体黏膜免疫产生SIgA抗体。SIgA抗体在黏膜免疫中起到重要的作用。
　　 1、对猪肺炎支原体组织毒毒力进行鉴定，并制备了标准阴阳性支气管-肺泡灌洗液样本。本次研究以总蛋白作为标准品进行校正，降低了样本采集而产生的误差。
　　 2、利用实验室保存的猪肺炎支原体P36、P46、P97R1阳性质粒，用大肠杆菌表达系统表达了多种免疫蛋白;为猪肺炎支原体抗体检测方法的建立奠定了基础。
　　 3、建立了单个蛋白的间接ELISA方法，并对该方法进行了优化。本次实验重点为对封闭液进行优化，降低封闭液与样本之间的非特异性反应，最终选择1％酪蛋白作为封闭液，然后将ELISA其它工作条件进行固定，用于检测包被不同蛋白后样本特异性SIgA抗体水平。优化并固定的程序如下:将待包被蛋白用包被液稀释至2μg/mL。包被96孔酶标板，100μL/孔37℃1h，4℃包被过夜;1％酪蛋白，200μL/孔37℃封闭2h;支气管-肺泡灌洗液样本1∶20稀释，鼻试子样本不稀释，100μL/孔37℃2h。羊抗猪IgA-HRP1∶10000稀释100μL/孔37℃1h;然后用TMB显色液在37℃作用12min，最后用2M H2SO4终止反应。此外，检测血清中特异性的IgA间接ELISA检测方法的工作条件为:将待包被蛋白用包被液稀释至4μ g/mL。包被96孔酶标板，100μL/孔37℃1h4℃包被过夜;1％酪蛋白200μL/孔37℃封闭1h;血清样本1∶20稀释100μL/孔37℃1h。羊抗猪IgA-HRP稀释至1∶10000，100μL/孔37℃1h;然后用TMB显色液在37℃作用10min，最后用2M H2SO4终止反应。
　　 4、建立了用于检测猪呼吸道IgA抗体的双抗夹心ELISA方法，并对此方法进行了优化，优化后的程序如下:将待鼠抗猪IgA单抗蛋白用包被液稀释至1μg/mL。包被96孔酶标板，100μL/孔37℃1h，4℃包被过夜;1％酪蛋白200μL/孔37℃封闭2h;支气管-肺泡灌洗液样本1∶100稀释100μL/孔37℃2h。羊抗猪IgA-HRP1∶15000稀释，100μL/孔37℃1h;然后用TMB显色液在37℃作用5min，最后用2M H2SO4终止反应。
　　 5、本试验所建立的间接ELISA方法对Mhp组织强毒攻毒后的鼻试子样本中特异性SIgA进行检测发现:Mhp阴性猪在攻毒后，在第6d能够检测到特异性SIgA抗体并在16d达到高峰;Mhp阳性猪在攻毒后的24小时内特异性SIgA抗体水平都开始下降，到第2d达到最低，随后开始恢复。P97R1、P46、P36三种蛋白的特异性SIgA的分泌规律具有一致性。这表明，P97R1、P46、P36三种蛋白都可以作为包被抗原用于呼吸道中Mhp特异性SIgA的ELISA建立。Mhp阴性猪感染后，在攻毒后第7d能够检测到血清中的P97R1特异性的IgA抗体并一直升高至28d;然而，整个试验过程都未能检测到P46，P36特异性IgA抗体。

目录

声明

摘要

缩略语及符号

第一篇 文献综述

1 黏膜抗体在疫苗效力检验中的意义

1．1 简介

2．2 疫苗免疫效果的评价与免疫监测

2．3 黏膜抗体的功能

2．4 黏膜抗体在疫苗效力评价中的研究

2．5 展望

2 猪肺炎支原体免疫学研究进展

2．1 P97蛋白

2．2 P46蛋白

2．3 P36蛋白

2．4 脂蛋白类P65

2．5 NrdF蛋白

3 猪支原体肺炎诊断方法研究进展

3．1 基层常用的诊断方法

3．2 实验室常用的诊断方法

参考文献

第二篇 研究内容

第一章 主要包被抗原的表达及免疫原性的鉴定

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第二章 SIgA-间接ELISA标准品的制备

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第三章 MHP单蛋白特异性IgA-间接ELISA方法及猪IgA双抗夹心ELISA方法的优化及建立

1 材料与方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

第四章 MHP感染后特异性IgA抗体分泌规律研究

1 材料与方法

2 鼻试子中特异性SIgA抗体检测结果的校准方法

2 实验结果

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢

攻读学位期间发表的论文