猪流感H3N2病毒感染早期诱导猪呼吸道产生多种特异性IgA抗体及其分泌规律研究

摘要

猪流感（Swine Influenza, SI）是一种急性、传染性呼吸道疾病，不仅严重影响养殖业的健康发展，还能感染人群，具有重要的公共卫生学意义。该病发病快，病程短，传播迅速，且易发生变异。感染猪可出现食欲下降、发热、咳嗽、打喷嚏、流鼻涕、精神萎靡等症状。其病原猪流感病毒(Swine Influenza virus，SIV)大部分属A型流感RNA病毒，其遗传特性由NA、M、PB、PA、NP、HA和NS8个基因片段决定。H3N2是该病毒常见亚型。目前国内外对流感病毒免疫分子的作用和流感疫苗效力的研究多以鼠、鸡等小动物作为研究对象，而对猪流感研究较少。近来研究表明猪是人、禽、猪流感病毒共同的易感宿主，是流感病毒基因重排的“混合器”和流感变异毒株产生的“孵化器”。本研究主要从宿主呼吸道黏膜免疫系统应答猪流感病毒H3N2感染反应方面开展，研究结果可以对猪流感抗体水平监测和猪流感防控提供参考价值。实验通过人工表达猪流感H3N2病毒8个基因片段的融合蛋白，分别以之作为包被抗原建立间接sIgA-ELISA方法，并检测同种毒株感染不同品种猪群后，呼吸道多种特异性sIgA抗体的分泌规律。主要分为以下两个方面:
　　1.猪流感病毒蛋白的表达与鉴定
　　分别扩增猪流感病毒流行毒株A/swine/guangdong/2006(H3N2)的NA、M1、M2、PB1、PA、HA1、NP和NS18个基因片段，双酶切后分别连接到pET32a(+)和pColdⅠ表达载体上，构建pET32a(+)-M1、pET32a(+)-NS1、pET32a(+)-PB1、 pET32a(+)-NP、pColdI-HA1、pET32a(+)-NA、pET32a(+)-M2和pET32a(+)-PA等8种重组质粒。重组质粒经测序正确后，转染大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，成功获得M1、NS1和PB1三种融合蛋白，蛋白分子量分别约为40 kDa、42 kDa和30 kDa。最后，用抗猪流感H3N2病毒阳性猪血清进行Western blot分析，表明融合蛋白具有良好的抗原性。
　　2.攻毒后猪特异性sIgA抗体分泌规律的研究
　　培养猪流感病毒，收获病毒并测定TCID50。分别对二元杂交猪与巴马猪进行猪流感病毒攻毒感染试验，并在21天内不同时间点采集鼻拭子样品。最后，用三种融合蛋白建立的间接ELISA方法检测猪鼻腔中蛋白抗原对应的特异性sIgA抗体。结果表明SIV感染后第5日，鼻腔中抗三种蛋白特异性sIgA抗体分泌均出现明显增加，感染后14日达到高峰，感染后21日开始下降，但抗三种蛋白特异性sIgA抗体变化差异不显著(P＞0.05);感染组中仅巴马猪抗PB1蛋白sIgA抗体分泌量稍高于二元猪，且在第14日和21日时差异显著(P＜0.05)，抗其他蛋白的sIgA抗体在两种猪之间无显著差异(P＞0.05);感染组sIgA抗体变化与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一篇 文献综述

1 猪流感病原学

1．1 分类和命名

1．2 培养特性

1．4 对理化因子的抵抗性

2 SIV生物学特性

3 猪流感病毒遗传进化、感染免疫机制和致病机理

3．1 感染和增殖过程

3．2 宿主免疫

3．3 致病机理

4 猪流感流行病学

5 猪流感临床症状和病理变化

6 诊断和检测

第二篇 实验部分

第一章 猪流感病毒各功能基因重组蛋白表达与鉴定

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 猪流感病毒H3N2特异性sIgA抗体分泌规律研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

附录

致谢