鼎湖鳞伞菌丝体多糖的发酵条件优化、分离纯化、抗肿瘤活性及其机制的研究

摘要

蘑菇作为人类的食物和药物在世界上已经有数千年的使用历史了。蘑菇中含有丰富的营养物质和医药用途物质，包括大量的碳水化合物、蛋白质、维生素，硫胺素，核黄素，抗坏血酸，维生素D，以及矿物质等。现代医学研究表明，蘑菇多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降胆固醇、降血糖、抗菌和抗病毒、抗过敏和抗炎、保肝护肝和肠道益生等功能。鼎湖鳞伞(Pholiota dinghuensis Bi)为中国特有种，是Pholiota属中的一个新种，1985年发现于我国广东省。目前关于鼎湖鳞伞菌丝体多糖的研究尚未见报道。因此，本论文主要对鼎湖鳞伞菌丝体的发酵条件优化、多糖分离纯化、理化性质研究、体内抗CCl4诱导小鼠急性肝损伤、体外抗癌活性筛选、抑制人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖以及诱导其凋亡的信号通路进行了研究。主要研究结果如下:
　　 1.液体发酵制备鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖的条件优化首先通过单因素试验筛选了发酵产生鼎湖鳞伞菌丝体多糖的培养基成分以及发酵条件。初步确定了适于鼎湖鳞伞菌丝体多糖的最佳培养基配方为复合碳源(葡萄糖和玉米粉)40 g/L、复合氮源（蛋白胨和酵母膏）4g/L、KH2PO41 g/L和MgSO41.5 g/L，最佳的接种量为15％(v/v)，培养温度为25℃，摇床转速为140 rpm。
　　 然后在单因素优化基础上采用部分组成因子设计(FFD)试验研究了不同培养基成分对鼎湖鳞伞菌丝体多糖的显著性影响。结果发现，葡萄糖、玉米粉和酵母膏对鼎湖鳞伞菌丝体多糖的产量最为显著。进一步采用爬坡试验得到葡萄糖、玉米粉和酵母膏浓度中心点分别为35、10和5 g/L。并以此为中心点，采用中心组成因子设计(CCD)试验对显著性影响因素的浓度进行优化。结果表明，当葡萄糖、玉米粉和酵母膏的浓度分别为36.0、11.8和5.4 g/L时，鼎湖鳞伞菌丝体多糖产量达到757±38 mg/L，与预测值较为一致。统计分析表明该模型能有效的预测鼎湖鳞伞菌丝体多糖的产量。
　　 液体发酵得到的菌丝体经干燥、粉碎、热水浸提、乙醇沉淀、离心，然后用丙酮和乙醚依次洗涤、干燥，得到鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖。
　　 2.鼎湖鳞伞菌丝体多糖分离纯化与理化性质研究采用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析法对鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖进行初步分离，并采用葡聚糖G-100凝胶过滤柱层析法对各个组分进一步纯化，得到鼎湖鳞伞菌丝体多糖纯化组分PDP-1、PDP-2和PDP-3共三个组分，得率分别为60.25％、23.69％和4.61％。采用分子排阻液相法进一步分析了PDP-1、PDP-2和PDP-3，结果发现三种纯化多糖是均一的组分，分子量分别为1.59×105、7.20×105和3.53×105 Da。
　　 采用苯酚-硫酸法、间羟联苯法、考马斯亮蓝法和氯化钡-明胶比色法测定了多糖样品中的总糖、糖醛酸、蛋白质和硫酸基含量，结果表明鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖、PDP-1、PDP-2和PDP-3中总糖含量分别为86.95％、97.97％、94.46％和85.58％;在所测的各个多糖组分中，PDP-3含有较高的蛋白、糖醛酸和硫酸基含量。
　　 通过糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法测定了多糖样品的单糖组成。鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖、PDP-1、PDP-2和PDP-3中的葡萄糖含量分别为92.54％、92.24％、88.65％和67.83％。对于粗多糖而言，阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的比例分别为2.18％、1.06％、1.48％、0.92％、92.54％和1.82％。三个纯化组分中，与PDP-1和PDP-2相比，PDP-3的单糖组成更为复杂，其中PDP-3中含有鼠李糖和木糖，而PDP-1和PDP-2没有被检测到，且PDP-3中的岩藻糖、甘露糖和半乳糖含量均比PDP-1和PDP-2中的含量高。
　　 红外光谱扫描结果显示，鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖以及各个纯化样品的吸收峰表明了所有样品均具有多糖特征。图谱中特征吸收峰表明PDP-2和PDP-3是酸性多糖和硫酸酯化多糖;同时证明了PDP-3可能是一种多糖和蛋白或肽的复合物。紫外光谱扫描结果表明鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖及其各纯化组分在波长为280 nm左右有不同程度的吸收峰，表明各样品均含有一定的蛋白或者肽，但是PDP-3的蛋白比其它组分含量更高。
　　 3.鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖体内对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的肝保护作用采用四氯化碳诱导的小鼠急性肝损体内动物试验模型评价了鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖肝保护作用。结果表明，鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖能有效降低小鼠血清中的天门冬氨酸转移酶(AST)和丙氨酸转移酶(ALT)活性，并提高小鼠肝脏组织中SOD和GSH-Px的活性;同时研究发现，鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖能抑制四氯化碳诱导的小鼠肝组织中丙二醛(MDA)的含量;小鼠肝组织切染色结果显示高剂量鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖（每天200 mg/kg体重）能明显减轻四氯化碳导致的小鼠肝脏组织浸染、细胞形态结构和颜色变化，达到阳性对照的保肝护肝效果。实验结果表明鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损有明显的保护作用。
　　 4.鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖及其纯化组分体外抑制肿瘤细胞增殖活性与机理采用MTT法以人胃癌BGC-823细胞为模型，同时采用亚甲基蓝染色法以人肝癌HepG2细胞为模型，分别筛选了鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖及其纯化组分(PDP-1、PDP-2和PDP-3)的体外肿瘤细胞增殖抑制活性。结果发现，PDP-3具有较好的体外抗肿瘤细胞增殖的活性。然后，以人乳腺MCF-10A细胞、人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞株筛选了PDP-3体外对人乳腺细胞的增殖抑制活性。结果发现PDP-3对于非肿瘤化的人乳腺MCF-10A细胞没有明显增殖抑制作用，而对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞均具有非常显著增殖抑制作用;细胞划痕愈合试验结果表明PDP-3能有效降低MDA-MB-231细胞的浸染和转移能力。Western-blot试验结果发现，PDP-3能显著增加雌性激素依赖型的人乳腺癌MCF-7细胞中p21蛋白表达，同时能明显降低PCNA、Cyclin D1和CDK4的蛋白表达。
　　 5.PDP-3体外诱导人乳腺癌MCF-7凋亡及其抗癌机理采用Western-blot法测定了PDP-3处理对人乳腺癌MCF-7细胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-p53、p-p38、ASK1、TRAF2以及细胞核和细胞之中的ER-α等蛋白的表达影响。结果发现，PDP-3处理激活了人乳腺癌MCF-7细胞中p38/MAPK通路，通过提高p21蛋白表达，降低人乳腺癌MCF-7细胞中与细胞增殖(PCNA)和细胞周期相关蛋白（Cyclin D1和CDK4）表达，从而有效抑制了细胞增殖;同时通过增加Bax和降低Bcl-2表达，以及激活Caspase家族蛋白（Caspase-9和Caspase-3）共同诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡。上游蛋白表达结果证实PDP-3提高了p-p53、p-p38和ASK1蛋白表达，并降低TRAF2蛋白表达;同时研究发现，PDP-3处理能显著降低了人乳腺癌MCF-7细胞核和细胞质中雌激素受体ER-α蛋白的表达。TUNEL试验和DNA片段化试验结果分别证实了PDP-3能诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡。结合本论文第五和六章实验结果，总结出PDP-3抗人乳腺癌MCF-7细胞的信号通路图。

目录

声明

摘要

缩略语说明

第一章 绪论

1．1 文献综述

1．1．1 真菌的分类及概况

1．1．2 蘑菇中的生物活性物质

1．1．3 蘑菇的生物活性

1．1．4 药用蘑菇多糖研究概况

1．2 本文研究概述

1．2．1 立题依据

1．2．2 主要研究内容

参考文献

第二章 鼎湖鳞伞菌丝体多糖发酵条件优化

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．2 结果与讨论

2．2．1 最佳碳源和氮源的筛选结果

2．2．2 最佳接种量、温度和转速的筛选结果

2．2．3 显著性影响因子的筛选结果

2．2．4 显著性影响因子的爬坡实验

2．2．5 中心组成设计(CCD)实验结果

2．3 本章小结

参考文献

第三章 鼎湖鳞伞菌丝体多糖的分离纯化及其结构的初步鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验方法

3．2 结果与讨论

3．2．1 鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖的DEAE纤维素柱初步分离纯化

3．2．2 进一步Sephadex G-100葡聚糖凝胶分离结果

3．2．3 鼎湖鳞伞菌丝体多糖纯度鉴定与分子量测定结果

3．2．4 鼎湖鳞伞菌丝体多糖成分分析

3．2．5 鼎湖鳞伞菌丝体多糖组分单糖组成分析

3．2．6 鼎湖鳞伞菌丝体多糖组分的红外光谱分析

3．2．7 鼎湖鳞伞菌丝体多糖组分的紫外光谱分析

3．3 本章小结

参考文献

第四章 鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖体内肝损伤保护作用

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 实验结果

4．2．1 鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖对小鼠体重以及体内器官相对重量的影响

4．2．2 鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖对小鼠血清中AST和AST活性的影响

4．2．3 鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖对小鼠肝脏组织中SOD和GSH-Px活性的影响

4．2．4 鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖对小鼠肝脏组织中MDA含量的影响

4．2．5 鼎湖鳞伞菌丝体粗多糖对小鼠肝脏组织切片结果的影响

4．3 讨论

4．4 本章小结

参考文献

第五章 鼎湖鳞伞菌丝体多糖体外抗肿瘤活性及机制

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验方法

5．2 结果与讨论

5．2．1 鼎湖鳞伞菌丝体多糖体外抑制肿瘤细胞增殖效果

5．2．2 PDP-3对人乳腺癌MDA-MB-231细胞划痕愈合的影响

5．2．3 PDP-3对人乳腺癌MCF-7细胞增殖以及细胞周期蛋白表达的影响

5．3 本章小结

参考文献

第六章 鼎湖鳞伞菌丝体多糖PDP-3诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其机制

6．1 材料与方法

6．1．1 实验材料

6．1．2 实验方法

6．2 实验结果

6．2．1 PDP-3对MCF-7细胞中Bcl-2和Bax表达的影响

6．2．2 PDP-3对MCF-7细胞中Caspase-9和Caspase-3表达的影响

6．2．3 PDP-3对MCF-7细胞中p-p53和p-p38表达的影响

6．2．4 PDP-3对MCF-7细胞中ASK1和TRAF2表达的影响

6．2．5 PDP-3对MCF-7细胞核和细胞质中ER-α表达的影响

6．2．6 PDP-3处理诱导MCF-7细胞凋亡的作用

6．2．7 PDP-3处理诱导MCF-7细胞中DNA片段化的作用

6．3 讨论

6．4 本章小结

参考文献

全文结论与展望

创新点

致谢

博士期间论文发表和专利申请情况