脑心肌炎病毒VP1蛋白间接ELISA抗体检测方法与灭活疫苗研究

摘要

脑心肌炎病毒（Encephalomycoarditis，EMCV）属于微RNA病毒科心病毒属，是一种无囊膜的单正股RNA病毒，可以感染昆虫、爬行动物、啮齿类动物和灵长类动物等，可以引起仔猪的致命性心肌炎和母猪的繁殖障碍。目前，我国猪群已有该病毒感染报道，但相关研究还不多。本文采用脑心肌炎病毒重组VP1蛋白，建立成功间接ELISA抗体检测方法，并对EMCV灭活疫苗进行了初步研究。具体内容如下:
　　 1.脑心肌炎病毒VP1基因的原核表达与蛋白纯化
　　 本研究根据EMCV结构蛋白VP1基因序列设计引物，通过RT-PCR方法扩增获得EMCV VP1基因，克隆至原核表达载体pET-32a，构建重组质粒pET-32a-VP1，经酶切和测序鉴定，基因序列全长852bp。重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经IPTG诱导后能够稳定表达VP1蛋白。通过对诱导菌液浓度、诱导剂浓度及诱导时间的筛选，确定了EMCV VP1蛋白诱导表达的最佳条件，即菌液浓度1.0(OD600)1.0mM IPTG诱导8小时表达效率较高。采用亲和层析方法获得纯化目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot结果显示该重组蛋白具有良好反应原性。
　　 2.脑心肌炎病毒VP1蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立和应用
　　 本研究采用大肠杆菌表达的EMCV VP1蛋白，建立间接ELISA抗体检测方法。优化的反应条件为:抗原包被浓度为2μg/mL，血清稀释度为1∶50，孵育时间1h，酶标SPA稀释度为1∶10000，作用时间为30 min。判定标准为:P/N值≧2.1，且OD450≧0.40为阳性，OD450≦0.30为阴性，介于二者之间的为可疑。该方法与CSFV、PRRSV、PCV2、PRV抗体反应均呈阴性，证明其具有良好的特异性，采用该方法对江苏省境内7家规模化猪场的115份血清样品进行检测，结果表明，EMCV已经在江苏地区规模化猪场存在，血清抗体阳性率为13.0％。
　　 3.脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法关键试剂保存方法及其稳定性的研究
　　 本研究选择不同的抗原保护剂、血清保护剂、洗涤液保护剂分别处理ELISA方法关键试剂，测定其4℃保存时间。结果为:抗原包被的酶标板经含10％硫酸铵的0.01mo/LTris-HCL缓冲液孵育45 min，4℃条件下可保存12个月;血清和洗涤液加入终浓度为0.2‰硫柳汞，4℃条件下可保存12个月以上。3批酶标SPA和TMB显色液的稳定性测定结果为:酶标SPA和TMB显色液的批间和批内变异系数均在10％以内。从而为EMCV抗体检测试剂盒的研制奠定了重要基础。
　　 4.脑心肌炎病毒灭活疫苗制备与免疫效力研究
　　 本研究使用终浓度为0.2mM的BEI对EMCV进行灭活处理，分别采用ISA201、ISA15A、GEL、CP940和1313佐剂配制成5种灭活疫苗。取6周龄Balb/c小鼠随机分为7组，每组5只，第1～6组分别皮下免疫由以上5种佐剂配制的疫苗及未加佐剂的灭活抗原，第7组皮下注射2％ DMEM作为阴性对照，间隔3周后进行加强免疫，0.2mL/只。首免后3、6周分别采血测其ELISA抗体水平和中和抗体水平，并分离脾脏细胞进行淋巴细胞转化试验。首免后6周采用EMCV NJ08毒株进行攻毒，腹腔内注射100LD50/只，观察临床症状和病理变化，并检测脑组织中EMCV抗原。结果为:二免后3周各佐剂免疫组小鼠的ELISA抗体水平均达1∶1600以上，其中ISA15A、ISA201、GEL组的ELISA抗体水平均大于1∶3200;各佐剂组中和抗体水平相似，平均约1∶16; ISA15A、GEL组的淋巴细胞增殖转化刺激指数达3.0以上，略高于其它佐剂组(P＞0.05);攻毒后ISA15A、ISA201和GEL佐剂组保护率均为90％。用ISA15A佐剂配制的灭活疫苗两次免疫5头30日龄EMCV阴性健康仔猪，结果为:该疫接种动物均无异常表现，5头免疫仔猪两次免疫后3周中和抗体水平均在1∶128左右，表明EMCV ISA15A佐剂灭活疫苗安全性好，并具有较好免疫效果。

目录

声明

摘要

第一章 脑心肌炎研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 致病机理

4 诊断技术

4．1 病毒分离

4．2 血清学检测技术

4．3 病原学检测技术

5 疫苗

5．1 灭活疫苗

5．2 弱毒疫苗

5．3 亚单位疫苗

5．4 核酸疫苗

6 防治

参考文献

第二章 脑心肌炎病毒VP1基因原核表达与蛋白纯化

1 材料

1．1 病毒、细菌及载体质粒

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 EMCV VP1基因引物设计与合成

2．2 病毒基因组的提取

2．3 RT-PCR

2．4 原核表达载体的构建与鉴定

2．5 重组质粒pET-32a-VP1在大肠杆菌中的诱导表达与鉴定

2．6 重组蛋白诱导表达条件的优化

2．7 重组蛋白的大量表达及纯化

2．8 重组质粒稳定性测定

3 结果

3．1 pET-32a-VP1原核表达载体的构建与鉴定

3．2 重组蛋白表达鉴定

3．3 重组蛋白诱导表达条件优化

3．4 重组EMCV-VP1蛋白大量表达及纯化

3．5 重组质粒稳定性研究

4 讨论

参考文献

第三章 脑心肌炎病毒结构蛋白VP1间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

1 材料

1．1 材料与试剂

1．2 主要仪器

2 方法

2．1 间接ELISA反应条件优化

2．2 特异性试验

2．3 重复性试验

2．4 相对敏感性测定

2．5 血清样品检测

3 结果

3．1 ELISA方法的标准化

3．2 临界值的确定

3．3 特异性试验

3．4 重复性试验

3．5 相对敏感性测定

3．6 血清样品检测

4 讨论

参考文献

第四章 脑心肌炎病毒间接ELISA抗体检测方法关键试剂保存方法及其稳定性的研究

1 材料

1．1 主要试剂

1．2 主要仪器

2 方法

2．1 包被抗原保护剂的筛选和保存期测定

2．2 血清保护剂的筛选和保存期测定

2．3 洗涤液保护剂的筛选和保存期测定

2．4 酶标SPA稳定性的评价

2．5 TMB显色液的稳定性评价

3 结果

3．1 包被抗原保护剂的筛选及酶标板保存期测定

3．2 血清保护剂的筛选及其保存期测定

3．3 洗涤液保护剂的筛选及其保存期测定

3．4 酶标SPA稳定性测定

3．5 TMB显色液的稳定性测定

4 讨论

参考文献

第五章 脑心肌炎病毒灭活疫苗制备与免疫效力研究

1 材料

1．1 病毒和细胞

1．2 实验动物

1．3 主要试剂

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 病毒增殖

2．2 病毒TCID50测定

2．3 EMCV NJ08毒株对Balb／c小鼠LD50测定

2．4 灭活条件筛选

2．5 不同佐剂灭活疫苗的配制

2．6 小鼠免疫保护试验

2．7 仔猪免疫试验

2．8 数据统计分析

3 结果

3．1 病毒增殖与病毒滴度测定

3．2 病毒灭活方法的筛选

3．3 疫苗物理性状

3．4 疫苗小鼠免疫效果

3．5 仔猪免疫试验

4 讨论

参考文献

全文总结

致谢