表达猪繁殖与呼吸综合症病毒多表位肽重组猪痘病毒的构建

摘要

猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)能引起母猪生殖障碍和猪严重的呼吸系统疾病，对全球养猪业造成巨大经济损失，已经成为影响养猪业的主要疾病之一。目前已经有商业化的PRRSV弱毒苗和灭活苗，但现有疫苗保护力不足并存在若干缺点，因此迫切需要新的有效的PRRSV疫苗。表位疫苗和活病毒载体疫苗是在现代疫苗发展中出现的两种新型疫苗设计策略，本研究试图利用这两种方式研制新型PRRSV疫苗。
　　 为确定PRRSV中和抗体识别的抗原表位，本研究以3株具有高中和效价的PRRSV单克隆抗体A1、A2和A7为靶标，利用噬菌体展示随机12肽库从中筛选高亲和力的噬菌体变异体。经三轮亲和选择和ELISA检测，每株单抗均筛选到12个阳性克隆。测序结果发现，A1识别的12个阳性克隆中有7个序列为YSTNWKNLSSLS，所有阳性克隆中都包含NWKN基序;A2和A7识别的12个阳性克隆中分别有6个和5个都包含SRHDHIH基序。同源性分析表明，A1识别的NWKN基序与PRRSV的任何结构蛋白无同源性;A2和A7识别的SRHDHIH基序与PRRSV的结构蛋白GP3的囊膜外结构域存在高度同源性。表位预测发现，GP3中156到161位的PRHDNI免疫原性和亲水性高，很可能是一个线性中和表位。
　　 为利用基于表位的疫苗设计策略研制新型PRRSV疫苗，人工设计了一段长为321bp的多表位肽(HP)基因。将其克隆到表达载体pET-32a(+)中，通过PCR和双酶切鉴定重组质粒pET-32a-HP，然后将重组质粒pET-32a-HP转化进E.coliBL21，IPTG诱导表达PCR阳性克隆菌。SDS-PAGE显示，经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白HP大小约30kD。免疫印迹显示，重组蛋白HP能被PRRSV单克隆抗体A2、A7识别。
　　 为研制安全有效的新型PRRSV疫苗，本研究利用本实验室构建的带有eGFP标记的用于高效表达外源基因的重组猪痘病毒载体系统，通过与野生猪痘基因组发生同源重组，获得了一个表达多表位肽HP基因片段的重组猪痘病毒rSPV-HP。利用PCR、免疫印迹和间接免疫荧光对纯化10代的重组猪痘病毒rSPV-HP进行了鉴定，结果表明感染rSPV-HP的PK15细胞中表达大小为10KD的多表位肽HP。在免疫rSPV-HPICR小鼠内检测到高水平抗HP特异性抗体，抗PRRSV中和抗体效价为1∶60。希望该重组猪痘病毒rSPV-HP能成为新型PRRSV疫苗候选者用于预防猪感染PRRSV。

目录

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摘要

第一章 猪繁殖与呼吸综合症病毒分子免疫学研究进展

1 PRRSV的细胞受体

2 先天性免疫应答

2．1 TLR的识别

2．2 Ⅰ型干扰素应答

2．3 其他细胞因子的调节

2．4 免疫相关细胞表面分子的调节

3 适应性免疫应答

3．1 体液免疫

3．2 细胞免疫

3．3 中和抗体和细胞免疫的作用

3．4 调节性T细胞的作用

参考文献

第二章 PRRSV模拟中和表位的鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 亲和性噬菌体的筛选

2．2 阳性噬菌体短肽结合实验

2．3 测序结果分析

3 讨论

参考文献

第三章 多表位肽HP基因的设计及原核表达

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 PCR鉴定结果

2．2 重组质粒酶切鉴定

2．3 测序结果

2．4 蛋白表达纯化与免疫印迹分析

3 讨论

参考文献

第四章 表达多表位肽HP基因重组猪痘病毒的构建

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 基因扩增结果

2．2 载体构建结果

2．3 重组病毒的PCR鉴定结果

2．4 HP表达的鉴定

2．5 重组病毒的小鼠免疫实验

3 讨论

参考文献

全文总结

致谢