展示猪O型口啼疫病毒中和表位的重组T7噬菌体研究

摘要

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，是国际兽疫局(OIE)规定的A类传染病。在我国，该疫病危害位于重大动物疫病之首，对养殖业造成巨大经济损失。因此，研制安全、高效的口蹄疫新型疫苗具有十分重要的意义。VP1是FMDV最重要的抗原，它包含连续性线性B细胞抗原表位（G-H环），该表位可诱导机体产生高效价的中和抗体，是研制口蹄疫新型表位疫苗的首选靶标。
　　 T7噬菌体展示系统(T7 phage display)是近年来发展起来的一种优秀的新型多肽展示技术。该系统展示效率为415拷贝/粒子，T7噬菌体增殖迅速、制备成本低，是十分理想的B细胞表位展示载体。
　　 本文成功构建出展示FMDV G-H环的T7噬菌体，对重组噬菌体的生物学特性及免疫学特性进行了初步研究，为研制口蹄疫新型表位疫苗打下良好基础。全文的主要研究内容如下:
　　 1.重组噬菌体的构建
　　 在分析、比对我国近年猪O型口蹄疫流行毒株VP1氨基酸序列的基础上，确定了G-H环共有序列。根据T7噬菌体密码偏嗜性进行基因序列优化，化学合成G-H环基因。将该基因插入T7 Select415-1b载体中，经过包装蛋白体外包装拯救，获得重组噬菌体。用噬斑PCR及序列测定方法，筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体经过扩增、浓缩、纯化，用SDS-PAGE检测目标表位的表达，用Western-blotting确定目标表位的免疫原活性。结果表明，我们已成功地获得了重组噬菌体，目的基因序列插入正确、阅读框无移码，展示表达的目标表位分子量为41kD，与理论值相符，该多肽与特异性抗体具有良好的结合活性。
　　 2.重组噬菌体的生物学特性研究
　　 获得重组菌噬菌体后，对其生物学特性进行了系统研究，为规模制造抗原奠定基础。重组噬菌体的生物学特性研究包括噬菌体增殖条件，最佳感染复数(MOI)和一步生长曲线;重组噬菌体的热稳定性、pH值稳定性和传代稳定性等。结果表明，重组噬菌体最适增殖温度是37℃，最佳感染复数是10-4～10-5。重组噬菌体形成圆形噬斑，透明、边界清晰，直径为0.8～2.3mm。增殖液中添加Mg2+10 mmol/L或Ca2+5 mmol/L，重组噬菌体产量提高20％。重组噬菌体感染宿主后潜伏期为30min，爆发时间为150min，子代产量为126pfu/细胞。重组噬菌体具有良好的热稳定性、pH值稳定性和传代稳定性，重组噬菌体毒种用20％甘油可长期4℃保存，非常适用于疫苗制造。
　　 3.重组噬菌体的免疫原性研究
　　 将纯化的重组噬菌体悬液与206佐剂按54∶46比例混合，制备出实验用疫苗，免疫幼龄仔猪，测试其免疫效力。实验猪随机分为三组，每组5头。实验组颈部肌肉注射实验重组噬菌体疫苗1O11pfu/ml/头，阳性对照组注射市售猪O型口蹄疫合成肽疫苗1ml/头，同时设立不免疫空白对照组。共免疫注射2次，一免后2周加强免疫，每次免疫前及二免后两周前腔静脉采血，分离血清。应用猪O型口蹄疫合成肽ELISA试剂盒和液相阻断ELISA试剂盒，检测中和表位特异性抗体效价和中和抗体效价。结果表明，重组噬菌体免疫原性极强，免疫血清多肽ELISAOD值达到3.0，4/5免疫仔猪的中和抗体达到1∶64以上，抗体效价第14天、28天呈规律性增长。对比之下，市售合成肽疫苗免疫血清的OD值一般仅为1.0，未检测到中和抗体。

目录

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摘要

英文缩略词表

第一章 T7噬菌体的生物学特性

1．T7基因组的结构

2．T7噬菌体的吸附和穿入

3．T7 DNA的转录

4．T7 DNA的复制

5．T7 DNA的包装

6．细菌的裂解与T7的释放

参考文献

第二章 T7噬菌体表面展示技术的研究进展

1．T7噬菌体展示技术的基本原理

2．T7选择型噬菌体展示系统

3．T7噬菌体展示技术的应用

参考文献

第三章 口蹄疫病毒及其VP1基因研究进展

1．FMD的病原学

2．FMD的流行病学

3．FMDV基因组的结构和功能

4．O型口足帝疫病毒VP1基因研究进展

4．1 VP1蛋白

4．2 VP1基因在新型疫苗中的应用

参考文献

第四章 口蹄疫病毒VP1表位重组T7噬菌体的构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第五章 重组T7噬菌体生物学特性的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第六章 重组T7噬菌体免疫原性的初步研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

附录一

附录二

致谢