P-糖蛋白在猪肝脏、肾脏和肠组织中的表达及对口服恩诺沙星药动学的影响

摘要

P-gp由mdr1基因编码，首次在耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现，是ABC转运家族中第一个被发现的与肿瘤细胞多药耐药相关的蛋白。P-gp能识别和转运许许多多化学机构与相对分子质量差别很大的物质，包括抗菌药物、抗病毒药、抗癌药物、免疫抑制剂、抗心律失常药等等。P-gp除了在癌细胞中高表达外，在正常的器官和组织中也有分布，主要定位于具有分泌和排泄功能的细胞上皮。肠道是主要的吸收器官，肝脏、肾脏是主要的代谢、排泄器官，定位在肠道、肝脏、肾脏的P-gp是影响其底物药代动力学的主要因素。近年来的研究发现，P-gp的表达存在物种差异，而目前关于P-gp的研究主要集中在人类和啮齿类动物，有关猪组织中P-gp定位以及相关功能的数据却非常有限，故本试验首先采用免疫组织化学的方法研究了多药耐药蛋白P-gp在健康仔猪肝脏、肾脏和肠组织中的定位情况，并采用real-time RTPCR方法检测了不同组织中mdr1的mRNA表达水平，同时进一步探讨了P-gp对氟喹诺酮类抗菌药恩诺沙星的药动学影响，为进一步研究P-gp的功能和调控奠定基础。
　　 首先，我们采用免疫组织化学方法对猪肠道、肝脏和肾脏中的P-gp进行了定位，采集5头60日龄健康仔猪的肝脏、肾脏、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋后，连续5μm切片，37℃过夜烤片后，利用抗MDR1的抗体对以上组织中的P-gp进行组织定位。结果表明: P-gp主要定位于肝脏肝细胞间的胆小管膜上。在肾脏主要分布于近端小管和远端小管的细胞膜上。P-gp在小肠的不同部位也均有分布，主要位于于肠绒毛上皮细胞顶端及小肠腺腔面上皮细胞顶端。P-gp在大肠中主要分布在黏膜上皮细胞顶端和大肠腺上皮细胞顶端。
　　 然后选取gapdh为看家基因，采用real-time RT PCR方法检测了mdr1基因在健康猪十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肝脏和肾脏中的mRNA表达水平，为进一步研究P-gp的功能提供参考。我们选取5头60日龄健康三元仔猪作为研究对象，宰杀后迅速取其组织置于液氮中，后转入-80℃冰箱保存，提取肝脏、肾脏和肠组织的总RNA，反转后对mdr1基因进行了相对定量。结果显示mdr1在猪肝脏、肾脏和各肠组织中均有表达，表达量由高到低依次为:回肠、结肠、肝脏、空肠、十二指肠、直肠、盲肠和肾脏。其中回肠表达量最高，且与十二指肠、直肠相比差异显著（P=0.017，P=0.014），与盲肠和肾脏相比差异极显著（P=0.005，P=0.001）。mdr1在空肠、结肠和肝脏中的相对表达量与肾脏相比差异显著（P=0.046，P=0.018，P=0.030）。
　　 进一步建立了高效液相色谱(HPLC)的方法用于实时监测猪口服恩诺沙星后在血浆中的药物浓度变化，检测P-gp抑制剂维拉帕米对猪口服恩诺沙星的药动学影响。试验选用8头健康60日龄三元仔猪，体重19～21 kg，随机平均分为单剂量口服恩诺沙星组和维拉帕米处理组。恩诺沙星组动物单剂量(10mg/kg·bw)灌服恩诺沙星，维拉帕米处理组动物灌服维拉帕米(10 mg/kg·bw)30 min后，再灌服恩诺沙星(10 mg/kg·bw)，分别于0、0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、12和24 h从前腔静脉无菌采血，4℃，3500 rpm离心10 min分离血浆，采用HPLC法测定血浆中恩诺沙星的药物浓度，用3p97药动学软件处理血药浓度-时间数据，计算药动学参数。结果显示:恩诺沙星在猪体内的药动学模型符合一级吸收一室模型，其吸收速率常数ka=0.82±0.11，达峰时间为Tpeak=2.01±0.09，血浆中峰浓度为Cmax=3.39±0.12，消除半衰期为T1/2ke=2.50±0.23，药时曲线下面积AUC(0-2h)=13.57±0.96;用维拉帕米处理后，能显著促进恩诺沙星的吸收速度，表现为吸收速率常数（2.08±0.11）、达峰时间（1.17±0.05）极显著低于恩诺沙星对照组（P＜0.01）和AUC(0-2h)（16.50±0.44）显著高于恩诺沙星对照组(P＜0.05)。但其他药动学参数如Cmax（3.85±0.15）、T1/2ke（2.85±0.22）与恩诺沙星组比较差异不显著（P＞0.05）。
　　 综上结果，猪肝脏、小肠和肾脏中均有P-gp的分布和表达，其对氟喹诺酮类抗菌药恩诺沙星的体内过程具有一定影响，有必要对猪P-gp的功能及调控进一步研究。

目录

声明

摘要

符号及缩略语

引言

第一章 文献综述 P-糖蛋白的研究进展

1 ATP-结合盒转运蛋白概述

2 P-gp的结构及转运机制

2．1 P-gp的结构

2．2 P-gP的转运机制

3 P-gp的分布及生理功能

3．1 P-gP的分布

3．2 P-gP的生理功能

4 P-gP的底物、诱导剂与抑制剂

4．1 P-gP的底物

4．2 P-gP的诱导剂

4．3 P-gP的抑制剂

5 P-gp对药物代谢动力学的影响

5．1 P-gP对药物吸收的影响

5．2 P-gP对药物分布的影响

5．3 P-gP对药物代谢的影响

5．4 P-gP对药物排泄的影响

6 P-gP的相关研究进展

6．1 关于P-gp分布的研究

6．2 关于mdr1和P-gp表达的研究

6．3 P-gP对其底物药物影响方面的研究

参考文献

第二章 P-gp在猪肝脏、肾脏和肠组织中的分布

1 材料与方法

1．1 试剂配制与抗体

1．2 试验仪器

1．3 试验动物

1．4 方法

2 结果

2．1 P-gp在猪肝脏中的定位

2．2 P-gP在猪肾脏中的定位

2．3 P-gp在猪小肠中的定位

2．4 P-gP在猪大肠中的定位

3 讨论

参考文献

第三章 P-gp在猪肝脏、肾脏和肠组织中的mRNA表达

1 材料与方法

1．1 试剂

1．2 试验仪器

1．3 试验动物

1．4 方法

1．5 数据分析与统计

2 结果

2．1 RNA完整性鉴定

2．2 RNA及cDNA检测

2．3 mdr1 mRNA在猪肝脏、肾脏和肠组织不同部位的相对表达量

3 讨论

参考文献

第四章 P-gp对猪口服恩诺沙星药动学的影响

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

1．3 数据的处理

2 试验结果

2．1 恩诺沙星色谱检测方法的建立

2．2 药时曲线与药动学参数

3 分析与讨论

3．1 关于恩诺沙星在血浆中的处理方法和检测方法

3．2 关于P-gP对恩诺沙星药动学的影响

参考文献

全文结论

致谢