染料木素在小鼠过敏性腹泻模型中抗过敏作用及作用机制的研究

摘要

近年来食物过敏的发病率不断增加，这类疾病在严重时会导致过敏性休克，甚至死亡。对于食物过敏，目前还没有有效的治疗方法，严格避免与过敏原接触是临床上最重要的预防措施。染料木素(Genistein，GEN)是从大豆中提取的一种异黄酮类化合物，具有一定的免疫调节作用，由于其在乳腺癌、前列腺癌、心血管疾病、骨质疏松和绝经后综合症等疾病中的重要作用日益受到人们的关注。近年来临床上和实验室的大量研究表明染料木素具有一定的抗过敏作用，因此，本论文通过如下3个动物试验研究GEN在食物过敏性腹泻中的抗过敏作用，并对其可能的作用机制进行探讨:(1)在亚屏障环境下通过口服卵清蛋白构建BALB/c小鼠的过敏性腹泻模型，并对该模型中过敏反应和肠道菌群的变化进行分析;(2)分别在日粮中添加10 mg/kg和100 mg/kg的GEN，研究其对过敏性腹泻模型中过敏症状、过敏反应和肠道菌群的影响;(3)通过每天给BALB/c小鼠灌胃2 mg/kg BW和20 mg/kg BW的GEN，研究其对过敏性腹泻模型中肠粘膜屏障的影响。
　　 1.亚屏障环境下构建食物过敏性腹泻模型
　　 本实验旨在亚屏障环境下构建BALB/c小鼠的食物过敏性腹泻模型。首先用卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）对雄性BALB/c小鼠进行致敏，然后灌胃OVA诱导急性腹泻，建立BALB/c小鼠过敏性腹泻模型。ELISA检测血清OVA-特异性IgG1和总IgE水平，氯乙酸酯酶染色法计数空肠肥大细胞。结果发现，处理组小鼠经反复灌胃后出现腹泻，而对照组小鼠始终没有出现腹泻;与对照组小鼠相比，处理组小鼠血清OVA-特异性IgG1和总IgE水平均显著升高，空肠肥大细胞数量显著增加。这些结果表明，可以在亚屏障环境下通过口服OVA成功诱导BALB/c小鼠产生过敏性腹泻，建立食物过敏性腹泻模型。
　　 2.食物过敏性腹泻模型中肠道菌群的变化
　　 本研究旨在比较亚屏障环境下过敏性腹泻模型中肠道菌群的变化。本实验运用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技术和Real-time PCR技术分析结肠细菌菌群的变化。PCR-DGGE分析表明，致敏组和假致敏组小鼠结肠细菌菌群结构存在差异。Real-timePCR定量分析结果显示，OVA致敏组小鼠结肠乳酸杆菌数量显著减少，而双歧杆菌和总细菌数量变化不显著。提示食物过敏性腹泻小鼠结肠菌群结构失衡，特别是乳酸杆菌数量减少。
　　 3.GEN对食物过敏性腹泻的影响
　　 本研究旨在探讨OVA诱导的BALB/c小鼠过敏性腹泻模型中GEN的抗过敏作用。64只6～8周龄BALB/c，雌雄各半，随机分为8组(n=8)，分别为阴性对照组、阳性对照组、低剂量GEN素组(2 mg/kg BW/d)和高剂量GEN组（20 mg/kg BW/d），GEN通过添加到日粮中的方式给药。每次灌胃后观察并记录小鼠的腹泻状况，实验过程中记录小鼠的体重和日采食量，用于GEN摄入量的校正。结果发现，低GEN处理缓解雌鼠腹泻，高GEN处理加剧雌鼠腹泻;低GEN和高GEN处理均加剧雄鼠过敏性腹泻。这些结果表明，GEN对小鼠过敏性腹泻的作用具有剂量效应和性别效应。经校正后低剂量组雌鼠和雄鼠GEN实际摄入量分别为1.22 mg/kg BW和1.42 mg/kgBW，高剂量组分别为12.2 mg/kg BW和14.2 mg/kg BW。
　　 4.GEN对食物过敏性腹泻模型中过敏反应的影响
　　 之前的研究结果表明合适剂量的GEN处理对雌鼠过敏性腹泻具有一定的缓解作用，本研究从免疫学角度探讨GEN在过敏性腹泻模型中的抗过敏机制。比色法测定空肠和结肠组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，Real-time PCR法测定空肠细胞因子的表达水平，ELISA法检测血清OVA-特异性IgG1和总IgE水平，氯乙酸酯酶染色法计数空肠肥大细胞。结果发现，与阴性对照组相比，阳性对照组小鼠空肠和结肠MPO活性显著增加;空肠IL-13表达显著增加，而IFN-γ和IL10表达显著减少;血清OVA-IgG1和总IgE均显著增加;空肠和结肠肥大细胞数量均显著增加。与阳性对照组相比，低剂量GEN处理可以显著降低空肠MPO活力;显著降低空肠IL-13表达，并提高IFN-γ表达;显著降低空肠肥大细胞数量。与阳性对照组相比，高剂量GEN处理可以显著增加空肠肥大细胞数量。这些结果表明GEN通过改善肠道Th1/Th2平衡、抑制肠粘膜肥大细胞增生发挥其抗过敏作用。
　　 5.GEN对食物过敏性腹泻模型中肠道菌群的影响
　　 肠道菌群与宿主相互作用在预防过敏性疾病发生中发挥重要作用，本实验主要研究OVA诱导过敏性腹泻后小鼠肠道菌群结构的变化，以及GEN处理对肠道菌群结构的影响。本实验运用基于16S rRNA基因的PCR-DGGE技术和Real-time PCR技术分别对小鼠粪样，结肠内容物，以及空肠、回肠和结肠粘膜中肠道菌群的结构和数量进行分析。DGGE分析结果表明:小鼠粪样菌群结构在各实验组间无明显变化;小鼠结肠内容物和结肠粘膜菌群结构在各实验组间出现条带差异，在P组和H组中出现的一些条带经鉴定为Helicobacter typhlonicus，Desulfovibrio sp.ABHU2SB和Shigellaflexneri的最相似菌。相似性分析结果也发现不同组别样品分布在不同的簇。定量分析结果表明:结肠粘膜和内容物中大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、梭菌Ⅳ群、拟杆菌和总细菌均存在显著地分布差异，双歧杆菌、拟杆菌和总细菌存在显著的组别差异;空肠、回肠和结肠粘膜中乳酸杆菌、双歧杆菌和梭菌Ⅳ群存在显著地分布差异，乳酸杆菌存在显著的组别差异。这些结果表明，OVA诱导过敏性腹泻后，小鼠肠道菌群结构发生变化，特别是出现了一些与肠道炎症相关的病原菌，合适剂量的GEN处理可以抑制这些病原菌的定植，改善肠道菌群结构。
　　 6.GEN对食物过敏性腹泻模型中肠粘膜屏障的影响
　　 大量研究表明食物过敏患者中存在明显的肠道屏障功能损伤，本实验主要研究OVA诱导过敏性腹泻后小鼠肠道屏障结构的变化，以及GEN处理对肠道屏障结构的影响。32只雌性BALB/c小鼠随机分为4组(n=8)，分别为生理盐水假致敏的阴性对照组和OVA致敏的阳性对照组、低剂量染料木素(2mg/kg BW)组和高剂量染料木素(20mg/kg BW)组，染料木素通过灌胃的方式给药。实验结束后，记录所有小鼠的腹泻状况;HE染色观察小鼠空肠组织形态的变化;透射电镜观察小鼠空肠粘膜上皮细胞间连接的变化;Real-time PCR和Western blot分别用于空肠粘膜紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的mRNA水平和蛋白水平的表达分析;并对空肠肥大细胞数量和紧密连接蛋白表达进行相关性分析。HE染色结果表明相比于阴性对照组，阳性对照组小鼠绒毛变短、隐窝加深，绒毛高度和隐窝深度的比值显著降低;电镜结果表明阳性对照组小鼠空肠粘膜上皮细胞间连接严重受损;Real-timePCR和Westernblot结果表明阳性对照组小鼠空肠粘膜紧密连接蛋白Occludin，Claudin-1和ZO-1的表达均显著降低。相比于阳性对照组，低剂量染料木素处理缓解OVA诱导的过敏性腹泻，显著提高绒毛高度和隐窝深度的比值，改善空肠粘膜上皮细胞间连接，显著提高Claudin-1的mRNA表达水平和明显增加Occludin和ZO-1的蛋白表达量;而高剂量染料木素则加重小鼠的过敏反应，进一步降低Occludin的蛋白表达量。相关性分析结果表明，空肠粘膜肥大细胞的数量与空肠粘膜Occludin的mRNA表达水平呈显著地线性负相关。这些结果表明，OVA诱导过敏性腹泻后，小鼠肠道屏障结构受损，合适剂量的GEN处理对肠粘膜屏障结构具有保护作用，且肠道屏障结构受损与肠道肥大细胞增生有关。

目录

声明

摘要

缩略语中英文对照

引言

第一章 文献综述

第一节 大豆异黄酮的研究概况

1 大豆异黄酮的来源，分布和结构

2 大豆异黄酮的代谢

3 大豆异黄酮的生物学特性

4 大豆异黄酮的生物学功能

第二节 食物过敏的研究概况

1 食物过敏的免疫学机制

2 食物过敏的动物模型

3 食物过敏动物模型对临床上的启示

4 畜牧生产中的过敏性腹泻——仔猪断奶腹泻

第三节 肠道屏障与食物过敏

1 肠道屏障组成

2 食物过敏中的肠道屏障损伤的研究进展

第四节 肠道菌群与食物过敏

1 过敏性疾病中微生物和宿主的相互作用

2 微生物和宿主相互作用对免疫功能的影响

3 过敏性疾病中靶向肠道微生物的干预策略

第五节 本研究的目的意义和主要内容

参考文献

第二章 食物过敏性腹泻模型中过敏反应与肠道菌群的变化

第一节 亚屏障环境下构建食物过敏性腹泻模型

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 食物过敏性腹泻模型中肠道菌群的变化

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 染料木素对食物过敏性腹泻模型中过敏反应和肠道菌群的影响

第一节 染料木素对食物过敏性腹泻的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二节 染料木素对食物过敏性腹泻模型中过敏反应的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三节 染料木素对过敏性腹泻模型中肠道菌群的影响

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第四章 染料木素对食物过敏性腹泻模型中肠粘膜屏障的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文结论

创新点

附录

附录1

附录2

附录3

附录4

附录5

致谢

攻读学位期间发表的学术论文